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摘要：为了解烟草对不同价态硒的吸收及耐性机制，以水培烟株为材料，研究了不同浓度（0、2、5、10、20mgTL）se（vI）和se（Iv）对烟株硒吸收及叶片硒亚细胞分布的影响。结果表明：（1）水培液中加入se（v1）和se（Iv）处理，低浓度（<2mg几）对烟株生长有促进效果，高浓度（>5 mg/L）有抑制作用，且相同硒浓度下表现为se（IV）毒性大于se（VI）；（2）施硒处理烟株各部位硒含量增加显著，叶片以有机硒为主，无机硒主要以se（IV）形态存储：（3）烟株叶片和茎秆对se（VI）的亲和力大于se（IV），而根系对se（IV）的亲和力大于Se（VI）；（4）烟株叶片吸收的硒主要贮存在细胞质和细胞壁中，其次为线粒体和叶绿体；（5）同等硒用量下，se（v11处理叶片总硒及细胞壁、细胞质中硒含量大于Se（IV）处理。综合分析得出，水培条件下，烟株对se（VI）的吸收能力和耐受性均大于se（IV），原因为烟株吸收的se（vI）更易合成含硒氨基酸或蛋白质等积累在细胞质中和被细胞壁固定，进而缓解了硒的毒性。
关键词：硒：烟株；亚细胞分布；生长：吸收
中图分类号：$572.01
文章编号：1007-5119（2016）04-0037-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.007
硒是植物生长的有益元素，有研究发现植物体内约有10种含硒的有机化合物，其主要作用是增强免疫能力和抗逆性，促进植物生长。适量的硒能刺激硒积聚植物的生长，而强烈抑制硒非积聚植物的生长，在较高浓度下，大部分植物出现硒中毒症状，其生长和生理活动受到抑制。国内外主要研究植物对不同形态硒的吸收，关于植物亚细胞水平分布研究多见于Cd.Cu、Zn.As等（非）金属元素，而关于不同价态硒在植物亚细胞水平分布以及在植物叶片中的转化的研究较少。
本文以烟草为试验材料，采用水培的方法，研究不同浓度的se（vI）和se（IV）处理对烟株生长和硒含量的影响，分析了烟株各部位对硒的吸收能力、烟株叶片组织中硒的转化和亚细胞水平硒分布的差异，为了解烟株对不同价态硒的富集以及耐性机理提供科学依据。
1.材料与方法
1.1试验材料
云烟87烟苗，分析纯硒酸钠（se（vI））和亚硒酸钠（se（IV）），不透光塑料盆。
1.2试验方法
试验在温室大棚进行，选取长势一致的烟苗（四叶一心）用Hoagland营养液进行水培试验。应用长方形不透光塑料盆，上面覆盖泡沫板，钻孔，用海绵包裹烟苗茎部固定在孔中，将根系浸泡在营养液内，每盆栽烟苗3株。先用1/4营养液培养7d再用1/2营养液培养7 d然后换成完全营养液。每7天更换1次营养液，每天补充损失水分。每2天通1次气，每次1h。用全营养液培养14 d后分别加入硒酸盐和亚硒酸盐，硒浓度分别为2、5、10、20mg/L，同时设置对照（硒浓度为0），共9个处理，4次重复，每处理共12株。试验过程中，第1次加硒15d后，换营养液，再加入对应浓度的2种价态硒，再培养15d后进行烟株采收取样。
1.3样品采集与分析测定
每个处理选取长势一致的烟株4株（每盆1株），进行整株收获，用蒸馏水洗凈，105℃杀青30min，70℃烘干，研磨过60目筛，保存备用。烟株农艺性状采用YC/T142-1998方法进行测定，生物量采用称重法测定。每个处理另取长势一致的烟株4株（每盆1株）选中部叶相同位置的鲜叶片组织，剪碎混合后，应用改进后的差速离心法分离不同的烟叶亚细胞组分，叶片有机硒和无机硒采用超声破碎提取，各组分和形态硒应用AFS9800原子荧光光谱法测定。
2.结果
2.1se（VI）和se（Iv）对烟株生长的影响
由表1看出，随着se（VI）和se（Iv）浓度的增加，烟株叶长、叶宽、根长、叶数和株高都呈先增加再降低的趋势，在2mg/L处理达最大值。硒浓度大于5mg/L时，两种价态硒处理烟株农艺性状指标均小于对照，表明烟株生长受到了抑制。施用等量高浓度（>5 mg/L）硒，烟株农艺性状指标表现为se（VI）处理好于se（Ⅳ），说明高浓度se（Ⅳ）在水培条件下对烟株的毒害作用大于se（VI）。
2.2 se（VI）和se（Ⅳ）对烟株硒含量及有效性的影响
由表2看出，随着不同价态硒用量的增加，烟株各部位硒含量增加显著。Se（VI）处理，烟株根系硒含量在10mg/L达最大值，较对照增加了50.7倍：茎秆和叶片硒含量在20 mg/L达最大值，分别较对照增加了81.6倍和132.8倍：se（IV）处理，烟株根系、茎秆、叶片硒含量在20 mg/L达最大值，分别较对照增加了68.0、36.3和57.0倍。等量硒浓度，烟株根系硒含量为se（IV）大于Se（VI）处理：茎秆和叶片硒含量为Se（VI）大于se（IV）处理。
由表3看出，Se（VII）处理，烟株叶片和茎秆K分别为4.44和13.43 mg/L，较se（IV）处理降低了70.6%和25.7%cax分别为303.72和281.43 mg&g，较se（IV）处理增加了67.7%和91.7%。Se（VI）处理烟株根系ks和Cmax分别为2.34和204.12 mg/kg，是se（Iv）处理的2.6倍和0.79倍。上述分析说明水培烟株叶片和茎秆对Se（VI）的亲和力大于Se（IV），而根系对Se（1V）的亲和力大于se（VI）。
2.3 Se（VI）和Se（IV）对烟株叶片硒价态的影响
从表4看出，Se（VI）处理，叶片Se（1V）和se（VI）含量较对照均有显著增加，分别占总硒含量的7.6%-35.0%～1.3%-32.6%，无机形态硒以Se（IV）为主Ne（IV）处理，叶片se（Iv）含量显著增加，se（VI）含量增加不明显，分别占总硒含量的23.8%-51.3%和0.3%-3.7%，无机形态硒主要以se（IV）为主。施用两种价态硒，烟株叶片无机硒主要以Se（Ivl的形态存储，se（VI）处理虽然叶片无机态se（vI）含量增加，但仍以se（VI）为主要存储形态。另外，两种价态硒处理，叶片有机硒与无机硒比值大于1，说明烟株吸收的硒，在叶片中主要以有机硒的形态为主。 2.4 se（V1）和se（Iv）对烟株叶片亚细胞硒分布的影响
由表5看出，se（VI）处理，烟株叶片各亚细胞组分硒含量增加显著，总硒含量在10 mg/L达最大值，较对照增加了78.7倍，效果显著：叶片硒主要贮存在细胞质中（占总硒含量的47.6%-63.6%），其次为细胞壁（占总硒含量的24.5%-27.0%），再次为线粒体（占总硒含量的5.4%-17.9%），叶绿体硒含量最低（占总硒含量的3.4%-9.8%）。Se（IV）处理，烟株叶片细胞壁和细胞质硒含量增加显著，叶绿体和线粒体硒含量变化不明显：总硒含量在10 mg/L达最大值，较对照增加了19.3倍，效果显著：叶片硒主要贮存在细胞质（占总硒含量的58.2%-71.7%）和细胞壁（19.3%-33.8%）中，线粒体和叶绿体含量较少。比较不同价态硒对烟株叶片亚细胞组分硒含量的影响，表明两种价态硒均主要贮存在细胞质中，然后是细胞壁，再次为线粒体，叶绿体硒含量最低。另外，烟株叶片对se（VI）的吸收能力和耐受性均大于Se（IV）（se（VI）处理叶片总硒含量及细胞壁和细胞质中硒含量大于Se（IV）），说明环境中的se（IV）更易被烟株叶片吸收，并合成含硒氨基酸或蛋白质等物质积累在细胞质中和被细胞壁固定而缓解硒的毒性。
3.讨论
本研究中水培条件下施用se（VI）和se（IV），低浓度（<2mg/L）对烟株的生长发育有促进作用：高浓度（>5 mg/L）则有明显的抑制作用，与已有报道认为，适量硒浓度促进植物生长，提高植株生物量，但过量硒对植株有毒害作用相一致。研究表明相同高浓度Se（IV）对烟株生长的抑制大于se（V1），可能与植物对se（vI）与Se（iV）的吸收转化途径不同有关，植物对se（iv）和se（VI）的吸收、转化和分配有很大不同，两种形态硒的吸收和转运机制相对独立。另外，可能与吸收的se（VI）较Se（IV）更易合成含硒蛋白质或被细胞壁固定而增加烟株对硒的耐性有关。
植物体内硒转运的主要形态为se（V1），以se（Ⅳ）为硒源，被植物根部吸收后氧化成为se（VI）和其他硒化物向地上部转移至叶片，由于这一转化过程比根吸收的过程要慢很多，因此大量的se（Iv）会积累在根内，与文中研究结论相一致。本文利用Michaelis-Menten方程拟合发现水培烟株叶片和茎秆对se（VI）的吸收能力大于Se（IV）。有研究认为，植物在土壤盆栽条件下，根系對se（vI）的吸收能力大于Se（IV），与本文中水培条件下烟株根系对se（Ⅵ）的吸收能力小于Se（Iv）的研究结论不一致，其原因可能为土壤对se（iv）的吸附固定能力显著大于se（VI），而使Se（IV）生物有效性降低有关。
施用se（Ⅳ）和se（VI），烟株叶片硒形态以有机硒为主，无机形态只占较少部分，说明烟株在高硒环境下，叶片吸收的硒可以通过与氨基酸或蛋白质等相结合进行解毒。另外，施用se（Iv）和se（VI），烟株叶片中的无机硒都以se（iv）为主要形态，可能烟株吸收的se（VI）从根部转移到地上部，在叶片中被还原成se（Ivl，然后转化为有机硒化物进入其他组织：而烟株吸收的se（Iv）及其代谢产物主要积累在根部，少部分氧化为se（VI）转移到地上部，然后在叶片中再还原为se（Iv）参与硒的代谢。
（非）重金属积累通常会对植物亚细胞结构造成严重破坏，进而导致植物体出现各种生理生化反应，而其在细胞壁的沉淀以及细胞内的区隔化分布是植物内部解毒的两个重要途经。液泡和细胞质是植物细胞代谢副产品及废物囤积场所，其中含有的多种蛋白质、有机酸、有机碱等物质能与（非）重金属相结合，使其在细胞内被区隔化，而降低（非）重金属的毒性。本研究施用不同价态的外源硒，烟株叶片硒主要贮存在细胞质中，其次为细胞壁，线粒体和叶绿体硒含量最低，说明烟株叶片可通过区隔化分布和细胞壁沉淀两种途径来降低外界环境中硒对烟株的毒害，增强植株的耐受性。
4.结论
水培液中加se（vI）和se（Iv）处理，低浓度（<2mg几）对烟株生长有促进作用，高浓度（>5 mg/L）有明显的抑制效果，相同硒浓度下表现为se（IV）毒性大于se（VI）。烟株叶片以有机硒为主，无机硒主要以se（Iv）形态存储。水培烟株叶片和茎秆对se（VI）的亲和力大于se（Ⅳ），而根系对se（Iv）的亲和力大于se（VI）。烟株叶片吸收的硒主要贮存在细胞质和细胞壁中。同等硒用量下，se（vD处理叶片总硒含量及细胞壁、细胞质中硒含量均大于se（Iv）处理，表明烟株对se（IV）的吸收能力和耐受性均大于se（Iv）。另外，烟株对不同价态硒耐性差异的分子机制是今后进一步研究的方向。
关键词：硒：烟株；亚细胞分布；生长：吸收
中图分类号：$572.01
文章编号：1007-5119（2016）04-0037-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.007
硒是植物生长的有益元素，有研究发现植物体内约有10种含硒的有机化合物，其主要作用是增强免疫能力和抗逆性，促进植物生长。适量的硒能刺激硒积聚植物的生长，而强烈抑制硒非积聚植物的生长，在较高浓度下，大部分植物出现硒中毒症状，其生长和生理活动受到抑制。国内外主要研究植物对不同形态硒的吸收，关于植物亚细胞水平分布研究多见于Cd.Cu、Zn.As等（非）金属元素，而关于不同价态硒在植物亚细胞水平分布以及在植物叶片中的转化的研究较少。
本文以烟草为试验材料，采用水培的方法，研究不同浓度的se（vI）和se（IV）处理对烟株生长和硒含量的影响，分析了烟株各部位对硒的吸收能力、烟株叶片组织中硒的转化和亚细胞水平硒分布的差异，为了解烟株对不同价态硒的富集以及耐性机理提供科学依据。
1.材料与方法
1.1试验材料
云烟87烟苗，分析纯硒酸钠（se（vI））和亚硒酸钠（se（IV）），不透光塑料盆。
1.2试验方法
试验在温室大棚进行，选取长势一致的烟苗（四叶一心）用Hoagland营养液进行水培试验。应用长方形不透光塑料盆，上面覆盖泡沫板，钻孔，用海绵包裹烟苗茎部固定在孔中，将根系浸泡在营养液内，每盆栽烟苗3株。先用1/4营养液培养7d再用1/2营养液培养7 d然后换成完全营养液。每7天更换1次营养液，每天补充损失水分。每2天通1次气，每次1h。用全营养液培养14 d后分别加入硒酸盐和亚硒酸盐，硒浓度分别为2、5、10、20mg/L，同时设置对照（硒浓度为0），共9个处理，4次重复，每处理共12株。试验过程中，第1次加硒15d后，换营养液，再加入对应浓度的2种价态硒，再培养15d后进行烟株采收取样。
1.3样品采集与分析测定
每个处理选取长势一致的烟株4株（每盆1株），进行整株收获，用蒸馏水洗凈，105℃杀青30min，70℃烘干，研磨过60目筛，保存备用。烟株农艺性状采用YC/T142-1998方法进行测定，生物量采用称重法测定。每个处理另取长势一致的烟株4株（每盆1株）选中部叶相同位置的鲜叶片组织，剪碎混合后，应用改进后的差速离心法分离不同的烟叶亚细胞组分，叶片有机硒和无机硒采用超声破碎提取，各组分和形态硒应用AFS9800原子荧光光谱法测定。
2.结果
2.1se（VI）和se（Iv）对烟株生长的影响
由表1看出，随着se（VI）和se（Iv）浓度的增加，烟株叶长、叶宽、根长、叶数和株高都呈先增加再降低的趋势，在2mg/L处理达最大值。硒浓度大于5mg/L时，两种价态硒处理烟株农艺性状指标均小于对照，表明烟株生长受到了抑制。施用等量高浓度（>5 mg/L）硒，烟株农艺性状指标表现为se（VI）处理好于se（Ⅳ），说明高浓度se（Ⅳ）在水培条件下对烟株的毒害作用大于se（VI）。
2.2 se（VI）和se（Ⅳ）对烟株硒含量及有效性的影响
由表2看出，随着不同价态硒用量的增加，烟株各部位硒含量增加显著。Se（VI）处理，烟株根系硒含量在10mg/L达最大值，较对照增加了50.7倍：茎秆和叶片硒含量在20 mg/L达最大值，分别较对照增加了81.6倍和132.8倍：se（IV）处理，烟株根系、茎秆、叶片硒含量在20 mg/L达最大值，分别较对照增加了68.0、36.3和57.0倍。等量硒浓度，烟株根系硒含量为se（IV）大于Se（VI）处理：茎秆和叶片硒含量为Se（VI）大于se（IV）处理。
由表3看出，Se（VII）处理，烟株叶片和茎秆K分别为4.44和13.43 mg/L，较se（IV）处理降低了70.6%和25.7%cax分别为303.72和281.43 mg&g，较se（IV）处理增加了67.7%和91.7%。Se（VI）处理烟株根系ks和Cmax分别为2.34和204.12 mg/kg，是se（Iv）处理的2.6倍和0.79倍。上述分析说明水培烟株叶片和茎秆对Se（VI）的亲和力大于Se（IV），而根系对Se（1V）的亲和力大于se（VI）。
2.3 Se（VI）和Se（IV）对烟株叶片硒价态的影响
从表4看出，Se（VI）处理，叶片Se（1V）和se（VI）含量较对照均有显著增加，分别占总硒含量的7.6%-35.0%～1.3%-32.6%，无机形态硒以Se（IV）为主Ne（IV）处理，叶片se（Iv）含量显著增加，se（VI）含量增加不明显，分别占总硒含量的23.8%-51.3%和0.3%-3.7%，无机形态硒主要以se（IV）为主。施用两种价态硒，烟株叶片无机硒主要以Se（Ivl的形态存储，se（VI）处理虽然叶片无机态se（vI）含量增加，但仍以se（VI）为主要存储形态。另外，两种价态硒处理，叶片有机硒与无机硒比值大于1，说明烟株吸收的硒，在叶片中主要以有机硒的形态为主。 2.4 se（V1）和se（Iv）对烟株叶片亚细胞硒分布的影响
由表5看出，se（VI）处理，烟株叶片各亚细胞组分硒含量增加显著，总硒含量在10 mg/L达最大值，较对照增加了78.7倍，效果显著：叶片硒主要贮存在细胞质中（占总硒含量的47.6%-63.6%），其次为细胞壁（占总硒含量的24.5%-27.0%），再次为线粒体（占总硒含量的5.4%-17.9%），叶绿体硒含量最低（占总硒含量的3.4%-9.8%）。Se（IV）处理，烟株叶片细胞壁和细胞质硒含量增加显著，叶绿体和线粒体硒含量变化不明显：总硒含量在10 mg/L达最大值，较对照增加了19.3倍，效果显著：叶片硒主要贮存在细胞质（占总硒含量的58.2%-71.7%）和细胞壁（19.3%-33.8%）中，线粒体和叶绿体含量较少。比较不同价态硒对烟株叶片亚细胞组分硒含量的影响，表明两种价态硒均主要贮存在细胞质中，然后是细胞壁，再次为线粒体，叶绿体硒含量最低。另外，烟株叶片对se（VI）的吸收能力和耐受性均大于Se（IV）（se（VI）处理叶片总硒含量及细胞壁和细胞质中硒含量大于Se（IV）），说明环境中的se（IV）更易被烟株叶片吸收，并合成含硒氨基酸或蛋白质等物质积累在细胞质中和被细胞壁固定而缓解硒的毒性。
3.讨论
本研究中水培条件下施用se（VI）和se（IV），低浓度（<2mg/L）对烟株的生长发育有促进作用：高浓度（>5 mg/L）则有明显的抑制作用，与已有报道认为，适量硒浓度促进植物生长，提高植株生物量，但过量硒对植株有毒害作用相一致。研究表明相同高浓度Se（IV）对烟株生长的抑制大于se（V1），可能与植物对se（vI）与Se（iV）的吸收转化途径不同有关，植物对se（iv）和se（VI）的吸收、转化和分配有很大不同，两种形态硒的吸收和转运机制相对独立。另外，可能与吸收的se（VI）较Se（IV）更易合成含硒蛋白质或被细胞壁固定而增加烟株对硒的耐性有关。
植物体内硒转运的主要形态为se（V1），以se（Ⅳ）为硒源，被植物根部吸收后氧化成为se（VI）和其他硒化物向地上部转移至叶片，由于这一转化过程比根吸收的过程要慢很多，因此大量的se（Iv）会积累在根内，与文中研究结论相一致。本文利用Michaelis-Menten方程拟合发现水培烟株叶片和茎秆对se（VI）的吸收能力大于Se（IV）。有研究认为，植物在土壤盆栽条件下，根系對se（vI）的吸收能力大于Se（IV），与本文中水培条件下烟株根系对se（Ⅵ）的吸收能力小于Se（Iv）的研究结论不一致，其原因可能为土壤对se（iv）的吸附固定能力显著大于se（VI），而使Se（IV）生物有效性降低有关。
施用se（Ⅳ）和se（VI），烟株叶片硒形态以有机硒为主，无机形态只占较少部分，说明烟株在高硒环境下，叶片吸收的硒可以通过与氨基酸或蛋白质等相结合进行解毒。另外，施用se（Iv）和se（VI），烟株叶片中的无机硒都以se（iv）为主要形态，可能烟株吸收的se（VI）从根部转移到地上部，在叶片中被还原成se（Ivl，然后转化为有机硒化物进入其他组织：而烟株吸收的se（Iv）及其代谢产物主要积累在根部，少部分氧化为se（VI）转移到地上部，然后在叶片中再还原为se（Iv）参与硒的代谢。
（非）重金属积累通常会对植物亚细胞结构造成严重破坏，进而导致植物体出现各种生理生化反应，而其在细胞壁的沉淀以及细胞内的区隔化分布是植物内部解毒的两个重要途经。液泡和细胞质是植物细胞代谢副产品及废物囤积场所，其中含有的多种蛋白质、有机酸、有机碱等物质能与（非）重金属相结合，使其在细胞内被区隔化，而降低（非）重金属的毒性。本研究施用不同价态的外源硒，烟株叶片硒主要贮存在细胞质中，其次为细胞壁，线粒体和叶绿体硒含量最低，说明烟株叶片可通过区隔化分布和细胞壁沉淀两种途径来降低外界环境中硒对烟株的毒害，增强植株的耐受性。
4.结论
水培液中加se（vI）和se（Iv）处理，低浓度（<2mg几）对烟株生长有促进作用，高浓度（>5 mg/L）有明显的抑制效果，相同硒浓度下表现为se（IV）毒性大于se（VI）。烟株叶片以有机硒为主，无机硒主要以se（Iv）形态存储。水培烟株叶片和茎秆对se（VI）的亲和力大于se（Ⅳ），而根系对se（Iv）的亲和力大于se（VI）。烟株叶片吸收的硒主要贮存在细胞质和细胞壁中。同等硒用量下，se（vD处理叶片总硒含量及细胞壁、细胞质中硒含量均大于se（Iv）处理，表明烟株对se（IV）的吸收能力和耐受性均大于se（Iv）。另外，烟株对不同价态硒耐性差异的分子机制是今后进一步研究的方向。