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摘要：前期利用In-Fusion SMARTerTM cDNA Library-Construction Kit已完成玉米纹枯病菌WF-9菌株的全长cDNA文库，并进行EST分析。笔者在此基础上，将EST片段进行聚类拼接，得到一个长944 bp的序列，根据所得序列开放阅读框设计引物，克隆得到玉米纹枯病病菌y-谷氨酰转肽酶基因（GGT）cDNA序列，以生物信息学方法对其序列进行预测分析，并利用real-time PCR分析GGT在立枯丝核菌侵染玉米叶片不同时期的表达特性。结果表明，克隆所得617bp序列与EST序列完全相同，在GenBank进行Blastx同源比对，与gamma—glutamyhranspeptidase（Rhizoctoniasolani AG-3 RhslAP）有85%的同源性。实时荧光定量PCR表明，GGT在立枯丝核菌侵染玉米叶片各个时期均有表达，并存在明显差异，其中在病菌侵染玉米叶片24 h时表达量最高。
关键词：立枯丝核菌；GGT；基因克隆；表达分析
中图分类号：S435.131.4 9 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0039-03
玉米纹枯病是世界玉米产区广泛发生、危害严重的世界性病害之一。近年来，随着玉米栽培密度的提高，氮肥用量增加，形成有利于玉米纹枯病发生的小气候条件，该病在某些地区危害日益严重，有逐年加重的趋势。玉米纹枯病现已成为制约我国玉米持续增产的主要病害。
目前，关于真菌病害相关基因研究较多，杜欣可克隆了玉米纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶的基因，用该基因构建了酵母工程菌株，接种玉米叶片出现水浸状病斑。崔福浩成功克隆了β-1，4-内切纤维素酶基因，用该基因构建了酵母工程菌株，接种试验表明，该基因可以杀死植物细胞。还有一些与代谢有关的基因已被克隆，Bowyer等发现引起禾谷类全蚀病的禾顶囊壳菌（Gaeuman-nomyces gramins）产生燕麦素酶分解燕麦根表皮细胞内的皂角苷燕麦素，编码该酶的基因突变后禾顶囊壳菌也就失去了对燕麦的致病力。关于玉米纹枯病菌y-谷氨酰转肽酶基因（Gamma一对utamyltranspeptida-se，GGT）未见报道，y-谷氨酰转肽酶是一种催化肽基转移作用的酶，在H pylori诱导的线粒体介导的程序性细胞死亡中，主要是通过诱导线粒体释放细胞色素c进入细胞质和激活Caspase家族成员起作用，H pylori y-谷氨酰转肽酶（y—glutamyl transpeptidase，GGT）在分泌和成熟后通过离子键与细胞膜结合，将细菌和宿主细胞直接连接起来。y-谷氨酰转肽酶广泛存在于原核和真核细胞中，在动物体内主要存在于肾、肝、胰等脏器，在谷胱苷肽的新陈代谢中起到了重要作用。
笔者所在实验室构建了立枯丝核菌cDNA文库，获得了329个高质量ESTs序列。为了明确GGT在病菌侵染过程中的表达情况，通过对EST数据进行分析，根据所得序列设计引物，克隆了立枯丝核菌GGT，验证了前期EST序列测序结果。在此基础上，通过测定该基因在病原菌侵染过程中的表达量，探明该病原菌与寄主互作过程中的基因表达规律，为下一步研究侵染机制奠定基础。
1.材料与方法
1.1材料
玉米立枯丝核菌（Rhizoctonia solani AG-IlA）菌株WF-9，沈阳农业大学植物免疫研究所保存。立枯丝核菌在PDA培养基培养3d，刮取菌丝50～100mg，用于RNA提取、克隆。用离体叶片接种法，将培养3d的立枯丝核菌菌饼，放在玉米3叶1心期苗的叶片上进行接菌，分别取0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米叶片（水渍状发病处）100mg，用于各个侵染时期基因表达量分析。所有样品经液氮速冻，保存于-80℃备用。
1.2 RNA提取及cDNA第一链的合成
提取菌株WF-9生长第3天样品和0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米叶片总RNA，参照TaKaRa RNA提取试剂盒说明提取，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，使用Thermo公司Nano Drop ND 1000超微量分光光度计测定浓度，使用TaKaRa公司反转录试剂盒合成cDNA第一链。
1.3立枯丝核菌GGT的克隆
笔者所在实验室已经构建了玉米立枯丝核菌AG-1-IA的全长cDNA文库，并进行了全长cDNA的随机测序。在随机测序中，分离出GGT EST片段，通过软件拼接，得到长944 bp的基因，包含完整开放阅读框。本试验根据所得序列开放阅读框，利用软件primer premier 5.0设计特异性引物c06-f：5’-CACGCATACTCCCGACTACT-3’和c06-r：5’-GCAACACCATFCTFCCTFGA-3。以eDNA为模板进行PCR扩增，程序为95℃ 4min；95℃45s，54℃ 45s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min，4℃永久保存。PCR产物用天根切胶回收试剂盒回收，并与pMDl9-T载体（TaKaRa，日本）连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
1.4GGT序列及系统发育分析
利用软件包DNASTAR识别可读框、推测氨基酸序列、预测等电点和分子量。同源搜索Blast分析在NCBI的网页（http：//www.ncbi.nlnl.nih.gov/blast/）上完成，用Mega 4.0软件构建GGT氨基酸系统进化树。
1.5GGT表达分析
根据获得的GGT核酸序列设计荧光定量PCR引物C060fr-F：5’-CTATCGCTCAGGCCATFGTT-3’，C060fr-R：5’-ATGCGTCGATCTCCTTGTG-3’；以立枯丝核菌GAPDH（基因登录号AF339928）为内参基因，设计内参引物GAPDH—F：5’-GGTCGGCAAAGTCATACCAT-3’，GAPDH-R：5’-TCTGCGTCCTTCTTGGAGATA-3’。反应在BIO-RADCFX96荧光定量PCR仪（BIO—RAD，美国）上进行，反应体系为cDNA模板（50mg/uL）2.0uL、上下游引物（10umol/L）各1uL、SYBR@Prenlix Ex TaqⅡ12.5uL和dH2O 8.5uL，每个样品3个重复。反应程序为95℃ 30s；95 qC 5 s，60 qC 30 s（single），共40个循环；95℃ 1s，65℃15s，95℃（conti’nuous），溶解曲线测定；40℃ 30s。 2.结果与分析
2.1GGT的cDNA克隆
根据cDNA文库所获得序列开放阅读框设计特异性引物，以总RNA反转录得到的cDNA为模板，通过PCR扩增到600bp左右GGT的cDNA（图1）。经测序验证与EST片段序列一致，说明EST拼接序列结果正确。EST拼接测序得到一个长944 bp的序列，在NCBI进行BLASTx对测序结果进行同源性分析，与ganlnla-glutanlyhranspeptidase（Rhizoctonia-lani AG-3 RhslAP）有85%的同源性。利用NCBI站点的ORF finder进行6种可能的框架分析，发现该cDNA片段有一个完整的开放阅读框，最长的阅读框为110-802，长度为693bp，编码230个氨基酸（图2）。
2.2同源性分析
根据GGT氨基酸序列，采用BLASTX在NCBI上进行比对，下载了17条GGT同源序列，运用Mega 4.0软件构建系统进化树，结果显示克隆GGT与立枯丝核菌AG-3融合群同源性最近（图3）。
2.3GGT在侵染各个时期表达差异分析
利用实时荧光定量PCR（real-time PCR）技术，以立枯丝核菌GAPDH为内参，分析了GGT在立枯丝核菌不同侵染时间点（O、12、18、24、30、42、54、72 h）的表达情况。结果表明，GGT在立枯丝核菌侵染的各个时间点均有表达，但表达量存在明显差异，在侵染12、18h时可能由于玉米自身防卫反应，GGT表达量明显下调；而在24 h，GGT的表达量达到最高，可能是立枯丝核菌在寄主组织内迅速扩展，导致玉米叶片细胞开始程序性死亡，GGT的表达量达到最大；侵染54、72h表达量下降到相对平稳状态，可能是由于寄主大面积凋亡，病原与寄主互作概率减少造成的（图4）。
3.讨论
GGT是谷氨酰循环中的关键酶，可特异性催化y-谷氨酰基的转移反应。GGT具有诱导细胞凋亡的活性，目前被广泛接受的观点是线粒体在凋亡的调节中起到了关键的作用。GGT对细胞的基本功能是线粒体结构的维护，对膜的完整性及细胞分化和发育具有影响。GGT在真菌、植物细胞中代谢作用一直被忽略。在哺乳动物系统中，该酶已被反复使用，涉及谷胱甘肽重要的抗氧化响应功能，并与半胱氨酸输送到组织中。敲除GGT活性基因的小鼠有异常发育和早期死亡。为了进一步弄清Rhizoctonia solani GGT在细胞凋亡中的作用及探索Rhizoctonia solani的侵染机制。本试验采用RT—PCR、基因克隆和核酸测序技术首次获得R.solaniAG-IlA的GGT核酸序列，验证了前期EST序列测序的结果，EST拼接测序得到一个长944bp的序列，开放阅读框为110～802，长度为693 bp，编码230个氨基酸。相对分子量24.7ku，理论等电点4.68。为后续的功能研究、蛋白制备及其抗体研制提供了良好的试验材料。
经序列比对结果显示，本研究克隆得到的GGT与Rhizoc-tonga solani AG-3 RhslAP的GGT氨基酸同源性最高，达到85%；系统发育树构建结果显示与立枯丝核菌AG-3融合群同源性最近。后期利用real-time PCR分析GGT在立枯丝核菌侵染玉米叶片各个时间点的表达特性，表明GGT在立枯丝核菌侵染的各个时间点均有表达，但表达量存在明显差异，其中在病菌侵染玉米叶片24h时表达量最高。本研究只对玉米纹枯病菌y-谷氨酰转肽酶基因（GGT）进行了克隆，对病菌侵染玉米叶片不同时期的表达量进行了分析。GGT是否参与致病，还需进一步研究。
关键词：立枯丝核菌；GGT；基因克隆；表达分析
中图分类号：S435.131.4 9 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0039-03
玉米纹枯病是世界玉米产区广泛发生、危害严重的世界性病害之一。近年来，随着玉米栽培密度的提高，氮肥用量增加，形成有利于玉米纹枯病发生的小气候条件，该病在某些地区危害日益严重，有逐年加重的趋势。玉米纹枯病现已成为制约我国玉米持续增产的主要病害。
目前，关于真菌病害相关基因研究较多，杜欣可克隆了玉米纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶的基因，用该基因构建了酵母工程菌株，接种玉米叶片出现水浸状病斑。崔福浩成功克隆了β-1，4-内切纤维素酶基因，用该基因构建了酵母工程菌株，接种试验表明，该基因可以杀死植物细胞。还有一些与代谢有关的基因已被克隆，Bowyer等发现引起禾谷类全蚀病的禾顶囊壳菌（Gaeuman-nomyces gramins）产生燕麦素酶分解燕麦根表皮细胞内的皂角苷燕麦素，编码该酶的基因突变后禾顶囊壳菌也就失去了对燕麦的致病力。关于玉米纹枯病菌y-谷氨酰转肽酶基因（Gamma一对utamyltranspeptida-se，GGT）未见报道，y-谷氨酰转肽酶是一种催化肽基转移作用的酶，在H pylori诱导的线粒体介导的程序性细胞死亡中，主要是通过诱导线粒体释放细胞色素c进入细胞质和激活Caspase家族成员起作用，H pylori y-谷氨酰转肽酶（y—glutamyl transpeptidase，GGT）在分泌和成熟后通过离子键与细胞膜结合，将细菌和宿主细胞直接连接起来。y-谷氨酰转肽酶广泛存在于原核和真核细胞中，在动物体内主要存在于肾、肝、胰等脏器，在谷胱苷肽的新陈代谢中起到了重要作用。
笔者所在实验室构建了立枯丝核菌cDNA文库，获得了329个高质量ESTs序列。为了明确GGT在病菌侵染过程中的表达情况，通过对EST数据进行分析，根据所得序列设计引物，克隆了立枯丝核菌GGT，验证了前期EST序列测序结果。在此基础上，通过测定该基因在病原菌侵染过程中的表达量，探明该病原菌与寄主互作过程中的基因表达规律，为下一步研究侵染机制奠定基础。
1.材料与方法
1.1材料
玉米立枯丝核菌（Rhizoctonia solani AG-IlA）菌株WF-9，沈阳农业大学植物免疫研究所保存。立枯丝核菌在PDA培养基培养3d，刮取菌丝50～100mg，用于RNA提取、克隆。用离体叶片接种法，将培养3d的立枯丝核菌菌饼，放在玉米3叶1心期苗的叶片上进行接菌，分别取0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米叶片（水渍状发病处）100mg，用于各个侵染时期基因表达量分析。所有样品经液氮速冻，保存于-80℃备用。
1.2 RNA提取及cDNA第一链的合成
提取菌株WF-9生长第3天样品和0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米叶片总RNA，参照TaKaRa RNA提取试剂盒说明提取，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，使用Thermo公司Nano Drop ND 1000超微量分光光度计测定浓度，使用TaKaRa公司反转录试剂盒合成cDNA第一链。
1.3立枯丝核菌GGT的克隆
笔者所在实验室已经构建了玉米立枯丝核菌AG-1-IA的全长cDNA文库，并进行了全长cDNA的随机测序。在随机测序中，分离出GGT EST片段，通过软件拼接，得到长944 bp的基因，包含完整开放阅读框。本试验根据所得序列开放阅读框，利用软件primer premier 5.0设计特异性引物c06-f：5’-CACGCATACTCCCGACTACT-3’和c06-r：5’-GCAACACCATFCTFCCTFGA-3。以eDNA为模板进行PCR扩增，程序为95℃ 4min；95℃45s，54℃ 45s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min，4℃永久保存。PCR产物用天根切胶回收试剂盒回收，并与pMDl9-T载体（TaKaRa，日本）连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
1.4GGT序列及系统发育分析
利用软件包DNASTAR识别可读框、推测氨基酸序列、预测等电点和分子量。同源搜索Blast分析在NCBI的网页（http：//www.ncbi.nlnl.nih.gov/blast/）上完成，用Mega 4.0软件构建GGT氨基酸系统进化树。
1.5GGT表达分析
根据获得的GGT核酸序列设计荧光定量PCR引物C060fr-F：5’-CTATCGCTCAGGCCATFGTT-3’，C060fr-R：5’-ATGCGTCGATCTCCTTGTG-3’；以立枯丝核菌GAPDH（基因登录号AF339928）为内参基因，设计内参引物GAPDH—F：5’-GGTCGGCAAAGTCATACCAT-3’，GAPDH-R：5’-TCTGCGTCCTTCTTGGAGATA-3’。反应在BIO-RADCFX96荧光定量PCR仪（BIO—RAD，美国）上进行，反应体系为cDNA模板（50mg/uL）2.0uL、上下游引物（10umol/L）各1uL、SYBR@Prenlix Ex TaqⅡ12.5uL和dH2O 8.5uL，每个样品3个重复。反应程序为95℃ 30s；95 qC 5 s，60 qC 30 s（single），共40个循环；95℃ 1s，65℃15s，95℃（conti’nuous），溶解曲线测定；40℃ 30s。 2.结果与分析
2.1GGT的cDNA克隆
根据cDNA文库所获得序列开放阅读框设计特异性引物，以总RNA反转录得到的cDNA为模板，通过PCR扩增到600bp左右GGT的cDNA（图1）。经测序验证与EST片段序列一致，说明EST拼接序列结果正确。EST拼接测序得到一个长944 bp的序列，在NCBI进行BLASTx对测序结果进行同源性分析，与ganlnla-glutanlyhranspeptidase（Rhizoctonia-lani AG-3 RhslAP）有85%的同源性。利用NCBI站点的ORF finder进行6种可能的框架分析，发现该cDNA片段有一个完整的开放阅读框，最长的阅读框为110-802，长度为693bp，编码230个氨基酸（图2）。
2.2同源性分析
根据GGT氨基酸序列，采用BLASTX在NCBI上进行比对，下载了17条GGT同源序列，运用Mega 4.0软件构建系统进化树，结果显示克隆GGT与立枯丝核菌AG-3融合群同源性最近（图3）。
2.3GGT在侵染各个时期表达差异分析
利用实时荧光定量PCR（real-time PCR）技术，以立枯丝核菌GAPDH为内参，分析了GGT在立枯丝核菌不同侵染时间点（O、12、18、24、30、42、54、72 h）的表达情况。结果表明，GGT在立枯丝核菌侵染的各个时间点均有表达，但表达量存在明显差异，在侵染12、18h时可能由于玉米自身防卫反应，GGT表达量明显下调；而在24 h，GGT的表达量达到最高，可能是立枯丝核菌在寄主组织内迅速扩展，导致玉米叶片细胞开始程序性死亡，GGT的表达量达到最大；侵染54、72h表达量下降到相对平稳状态，可能是由于寄主大面积凋亡，病原与寄主互作概率减少造成的（图4）。
3.讨论
GGT是谷氨酰循环中的关键酶，可特异性催化y-谷氨酰基的转移反应。GGT具有诱导细胞凋亡的活性，目前被广泛接受的观点是线粒体在凋亡的调节中起到了关键的作用。GGT对细胞的基本功能是线粒体结构的维护，对膜的完整性及细胞分化和发育具有影响。GGT在真菌、植物细胞中代谢作用一直被忽略。在哺乳动物系统中，该酶已被反复使用，涉及谷胱甘肽重要的抗氧化响应功能，并与半胱氨酸输送到组织中。敲除GGT活性基因的小鼠有异常发育和早期死亡。为了进一步弄清Rhizoctonia solani GGT在细胞凋亡中的作用及探索Rhizoctonia solani的侵染机制。本试验采用RT—PCR、基因克隆和核酸测序技术首次获得R.solaniAG-IlA的GGT核酸序列，验证了前期EST序列测序的结果，EST拼接测序得到一个长944bp的序列，开放阅读框为110～802，长度为693 bp，编码230个氨基酸。相对分子量24.7ku，理论等电点4.68。为后续的功能研究、蛋白制备及其抗体研制提供了良好的试验材料。
经序列比对结果显示，本研究克隆得到的GGT与Rhizoc-tonga solani AG-3 RhslAP的GGT氨基酸同源性最高，达到85%；系统发育树构建结果显示与立枯丝核菌AG-3融合群同源性最近。后期利用real-time PCR分析GGT在立枯丝核菌侵染玉米叶片各个时间点的表达特性，表明GGT在立枯丝核菌侵染的各个时间点均有表达，但表达量存在明显差异，其中在病菌侵染玉米叶片24h时表达量最高。本研究只对玉米纹枯病菌y-谷氨酰转肽酶基因（GGT）进行了克隆，对病菌侵染玉米叶片不同时期的表达量进行了分析。GGT是否参与致病，还需进一步研究。