论文部分内容阅读
摘要:前期利用In-Fusion SMARTerTM cDNA Library-Construction Kit已完成玉米纹枯病菌WF-9菌株的全长cDNA文库,并进行EST分析。笔者在此基础上,将EST片段进行聚类拼接,得到一个长944 bp的序列,根据所得序列开放阅读框设计引物,克隆得到玉米纹枯病病菌y-谷氨酰转肽酶基因(GGT)cDNA序列,以生物信息学方法对其序列进行预测分析,并利用real-time PCR分析GGT在立枯丝核菌侵染玉米叶片不同时期的表达特性。结果表明,克隆所得617bp序列与EST序列完全相同,在GenBank进行Blastx同源比对,与gamma—glutamyhranspeptidase(Rhizoctoniasolani AG-3 RhslAP)有85%的同源性。实时荧光定量PCR表明,GGT在立枯丝核菌侵染玉米叶片各个时期均有表达,并存在明显差异,其中在病菌侵染玉米叶片24 h时表达量最高。
关键词:立枯丝核菌;GGT;基因克隆;表达分析
中图分类号:S435.131.4 9 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2015)05-0039-03
玉米纹枯病是世界玉米产区广泛发生、危害严重的世界性病害之一。近年来,随着玉米栽培密度的提高,氮肥用量增加,形成有利于玉米纹枯病发生的小气候条件,该病在某些地区危害日益严重,有逐年加重的趋势。玉米纹枯病现已成为制约我国玉米持续增产的主要病害。
目前,关于真菌病害相关基因研究较多,杜欣可克隆了玉米纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶的基因,用该基因构建了酵母工程菌株,接种玉米叶片出现水浸状病斑。崔福浩成功克隆了β-1,4-内切纤维素酶基因,用该基因构建了酵母工程菌株,接种试验表明,该基因可以杀死植物细胞。还有一些与代谢有关的基因已被克隆,Bowyer等发现引起禾谷类全蚀病的禾顶囊壳菌(Gaeuman-nomyces gramins)产生燕麦素酶分解燕麦根表皮细胞内的皂角苷燕麦素,编码该酶的基因突变后禾顶囊壳菌也就失去了对燕麦的致病力。关于玉米纹枯病菌y-谷氨酰转肽酶基因(Gamma一对utamyltranspeptida-se,GGT)未见报道,y-谷氨酰转肽酶是一种催化肽基转移作用的酶,在H pylori诱导的线粒体介导的程序性细胞死亡中,主要是通过诱导线粒体释放细胞色素c进入细胞质和激活Caspase家族成员起作用,H pylori y-谷氨酰转肽酶(y—glutamyl transpeptidase,GGT)在分泌和成熟后通过离子键与细胞膜结合,将细菌和宿主细胞直接连接起来。y-谷氨酰转肽酶广泛存在于原核和真核细胞中,在动物体内主要存在于肾、肝、胰等脏器,在谷胱苷肽的新陈代谢中起到了重要作用。
笔者所在实验室构建了立枯丝核菌cDNA文库,获得了329个高质量ESTs序列。为了明确GGT在病菌侵染过程中的表达情况,通过对EST数据进行分析,根据所得序列设计引物,克隆了立枯丝核菌GGT,验证了前期EST序列测序结果。在此基础上,通过测定该基因在病原菌侵染过程中的表达量,探明该病原菌与寄主互作过程中的基因表达规律,为下一步研究侵染机制奠定基础。
1.材料与方法
1.1材料
玉米立枯丝核菌(Rhizoctonia solani AG-IlA)菌株WF-9,沈阳农业大学植物免疫研究所保存。立枯丝核菌在PDA培养基培养3d,刮取菌丝50~100mg,用于RNA提取、克隆。用离体叶片接种法,将培养3d的立枯丝核菌菌饼,放在玉米3叶1心期苗的叶片上进行接菌,分别取0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米叶片(水渍状发病处)100mg,用于各个侵染时期基因表达量分析。所有样品经液氮速冻,保存于-80℃备用。
1.2 RNA提取及cDNA第一链的合成
提取菌株WF-9生长第3天样品和0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米叶片总RNA,参照TaKaRa RNA提取试剂盒说明提取,用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量,使用Thermo公司Nano Drop ND 1000超微量分光光度计测定浓度,使用TaKaRa公司反转录试剂盒合成cDNA第一链。
1.3立枯丝核菌GGT的克隆
笔者所在实验室已经构建了玉米立枯丝核菌AG-1-IA的全长cDNA文库,并进行了全长cDNA的随机测序。在随机测序中,分离出GGT EST片段,通过软件拼接,得到长944 bp的基因,包含完整开放阅读框。本试验根据所得序列开放阅读框,利用软件primer premier 5.0设计特异性引物c06-f:5’-CACGCATACTCCCGACTACT-3’和c06-r:5’-GCAACACCATFCTFCCTFGA-3。以eDNA为模板进行PCR扩增,程序为95℃ 4min;95℃45s,54℃ 45s,72℃ 1min,35个循环;72℃ 10min,4℃永久保存。PCR产物用天根切胶回收试剂盒回收,并与pMDl9-T载体(TaKaRa,日本)连接,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
1.4GGT序列及系统发育分析
利用软件包DNASTAR识别可读框、推测氨基酸序列、预测等电点和分子量。同源搜索Blast分析在NCBI的网页(http://www.ncbi.nlnl.nih.gov/blast/)上完成,用Mega 4.0软件构建GGT氨基酸系统进化树。
1.5GGT表达分析
根据获得的GGT核酸序列设计荧光定量PCR引物C060fr-F:5’-CTATCGCTCAGGCCATFGTT-3’,C060fr-R:5’-ATGCGTCGATCTCCTTGTG-3’;以立枯丝核菌GAPDH(基因登录号AF339928)为内参基因,设计内参引物GAPDH—F:5’-GGTCGGCAAAGTCATACCAT-3’,GAPDH-R:5’-TCTGCGTCCTTCTTGGAGATA-3’。反应在BIO-RADCFX96荧光定量PCR仪(BIO—RAD,美国)上进行,反应体系为cDNA模板(50mg/uL)2.0uL、上下游引物(10umol/L)各1uL、SYBR@Prenlix Ex TaqⅡ12.5uL和dH2O 8.5uL,每个样品3个重复。反应程序为95℃ 30s;95 qC 5 s,60 qC 30 s(single),共40个循环;95℃ 1s,65℃15s,95℃(conti’nuous),溶解曲线测定;40℃ 30s。 2.结果与分析
2.1GGT的cDNA克隆
根据cDNA文库所获得序列开放阅读框设计特异性引物,以总RNA反转录得到的cDNA为模板,通过PCR扩增到600bp左右GGT的cDNA(图1)。经测序验证与EST片段序列一致,说明EST拼接序列结果正确。EST拼接测序得到一个长944 bp的序列,在NCBI进行BLASTx对测序结果进行同源性分析,与ganlnla-glutanlyhranspeptidase(Rhizoctonia-lani AG-3 RhslAP)有85%的同源性。利用NCBI站点的ORF finder进行6种可能的框架分析,发现该cDNA片段有一个完整的开放阅读框,最长的阅读框为110-802,长度为693bp,编码230个氨基酸(图2)。
2.2同源性分析
根据GGT氨基酸序列,采用BLASTX在NCBI上进行比对,下载了17条GGT同源序列,运用Mega 4.0软件构建系统进化树,结果显示克隆GGT与立枯丝核菌AG-3融合群同源性最近(图3)。
2.3GGT在侵染各个时期表达差异分析
利用实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术,以立枯丝核菌GAPDH为内参,分析了GGT在立枯丝核菌不同侵染时间点(O、12、18、24、30、42、54、72 h)的表达情况。结果表明,GGT在立枯丝核菌侵染的各个时间点均有表达,但表达量存在明显差异,在侵染12、18h时可能由于玉米自身防卫反应,GGT表达量明显下调;而在24 h,GGT的表达量达到最高,可能是立枯丝核菌在寄主组织内迅速扩展,导致玉米叶片细胞开始程序性死亡,GGT的表达量达到最大;侵染54、72h表达量下降到相对平稳状态,可能是由于寄主大面积凋亡,病原与寄主互作概率减少造成的(图4)。
3.讨论
GGT是谷氨酰循环中的关键酶,可特异性催化y-谷氨酰基的转移反应。GGT具有诱导细胞凋亡的活性,目前被广泛接受的观点是线粒体在凋亡的调节中起到了关键的作用。GGT对细胞的基本功能是线粒体结构的维护,对膜的完整性及细胞分化和发育具有影响。GGT在真菌、植物细胞中代谢作用一直被忽略。在哺乳动物系统中,该酶已被反复使用,涉及谷胱甘肽重要的抗氧化响应功能,并与半胱氨酸输送到组织中。敲除GGT活性基因的小鼠有异常发育和早期死亡。为了进一步弄清Rhizoctonia solani GGT在细胞凋亡中的作用及探索Rhizoctonia solani的侵染机制。本试验采用RT—PCR、基因克隆和核酸测序技术首次获得R.solaniAG-IlA的GGT核酸序列,验证了前期EST序列测序的结果,EST拼接测序得到一个长944bp的序列,开放阅读框为110~802,长度为693 bp,编码230个氨基酸。相对分子量24.7ku,理论等电点4.68。为后续的功能研究、蛋白制备及其抗体研制提供了良好的试验材料。
经序列比对结果显示,本研究克隆得到的GGT与Rhizoc-tonga solani AG-3 RhslAP的GGT氨基酸同源性最高,达到85%;系统发育树构建结果显示与立枯丝核菌AG-3融合群同源性最近。后期利用real-time PCR分析GGT在立枯丝核菌侵染玉米叶片各个时间点的表达特性,表明GGT在立枯丝核菌侵染的各个时间点均有表达,但表达量存在明显差异,其中在病菌侵染玉米叶片24h时表达量最高。本研究只对玉米纹枯病菌y-谷氨酰转肽酶基因(GGT)进行了克隆,对病菌侵染玉米叶片不同时期的表达量进行了分析。GGT是否参与致病,还需进一步研究。
关键词:立枯丝核菌;GGT;基因克隆;表达分析
中图分类号:S435.131.4 9 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2015)05-0039-03
玉米纹枯病是世界玉米产区广泛发生、危害严重的世界性病害之一。近年来,随着玉米栽培密度的提高,氮肥用量增加,形成有利于玉米纹枯病发生的小气候条件,该病在某些地区危害日益严重,有逐年加重的趋势。玉米纹枯病现已成为制约我国玉米持续增产的主要病害。
目前,关于真菌病害相关基因研究较多,杜欣可克隆了玉米纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶的基因,用该基因构建了酵母工程菌株,接种玉米叶片出现水浸状病斑。崔福浩成功克隆了β-1,4-内切纤维素酶基因,用该基因构建了酵母工程菌株,接种试验表明,该基因可以杀死植物细胞。还有一些与代谢有关的基因已被克隆,Bowyer等发现引起禾谷类全蚀病的禾顶囊壳菌(Gaeuman-nomyces gramins)产生燕麦素酶分解燕麦根表皮细胞内的皂角苷燕麦素,编码该酶的基因突变后禾顶囊壳菌也就失去了对燕麦的致病力。关于玉米纹枯病菌y-谷氨酰转肽酶基因(Gamma一对utamyltranspeptida-se,GGT)未见报道,y-谷氨酰转肽酶是一种催化肽基转移作用的酶,在H pylori诱导的线粒体介导的程序性细胞死亡中,主要是通过诱导线粒体释放细胞色素c进入细胞质和激活Caspase家族成员起作用,H pylori y-谷氨酰转肽酶(y—glutamyl transpeptidase,GGT)在分泌和成熟后通过离子键与细胞膜结合,将细菌和宿主细胞直接连接起来。y-谷氨酰转肽酶广泛存在于原核和真核细胞中,在动物体内主要存在于肾、肝、胰等脏器,在谷胱苷肽的新陈代谢中起到了重要作用。
笔者所在实验室构建了立枯丝核菌cDNA文库,获得了329个高质量ESTs序列。为了明确GGT在病菌侵染过程中的表达情况,通过对EST数据进行分析,根据所得序列设计引物,克隆了立枯丝核菌GGT,验证了前期EST序列测序结果。在此基础上,通过测定该基因在病原菌侵染过程中的表达量,探明该病原菌与寄主互作过程中的基因表达规律,为下一步研究侵染机制奠定基础。
1.材料与方法
1.1材料
玉米立枯丝核菌(Rhizoctonia solani AG-IlA)菌株WF-9,沈阳农业大学植物免疫研究所保存。立枯丝核菌在PDA培养基培养3d,刮取菌丝50~100mg,用于RNA提取、克隆。用离体叶片接种法,将培养3d的立枯丝核菌菌饼,放在玉米3叶1心期苗的叶片上进行接菌,分别取0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米叶片(水渍状发病处)100mg,用于各个侵染时期基因表达量分析。所有样品经液氮速冻,保存于-80℃备用。
1.2 RNA提取及cDNA第一链的合成
提取菌株WF-9生长第3天样品和0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米叶片总RNA,参照TaKaRa RNA提取试剂盒说明提取,用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量,使用Thermo公司Nano Drop ND 1000超微量分光光度计测定浓度,使用TaKaRa公司反转录试剂盒合成cDNA第一链。
1.3立枯丝核菌GGT的克隆
笔者所在实验室已经构建了玉米立枯丝核菌AG-1-IA的全长cDNA文库,并进行了全长cDNA的随机测序。在随机测序中,分离出GGT EST片段,通过软件拼接,得到长944 bp的基因,包含完整开放阅读框。本试验根据所得序列开放阅读框,利用软件primer premier 5.0设计特异性引物c06-f:5’-CACGCATACTCCCGACTACT-3’和c06-r:5’-GCAACACCATFCTFCCTFGA-3。以eDNA为模板进行PCR扩增,程序为95℃ 4min;95℃45s,54℃ 45s,72℃ 1min,35个循环;72℃ 10min,4℃永久保存。PCR产物用天根切胶回收试剂盒回收,并与pMDl9-T载体(TaKaRa,日本)连接,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
1.4GGT序列及系统发育分析
利用软件包DNASTAR识别可读框、推测氨基酸序列、预测等电点和分子量。同源搜索Blast分析在NCBI的网页(http://www.ncbi.nlnl.nih.gov/blast/)上完成,用Mega 4.0软件构建GGT氨基酸系统进化树。
1.5GGT表达分析
根据获得的GGT核酸序列设计荧光定量PCR引物C060fr-F:5’-CTATCGCTCAGGCCATFGTT-3’,C060fr-R:5’-ATGCGTCGATCTCCTTGTG-3’;以立枯丝核菌GAPDH(基因登录号AF339928)为内参基因,设计内参引物GAPDH—F:5’-GGTCGGCAAAGTCATACCAT-3’,GAPDH-R:5’-TCTGCGTCCTTCTTGGAGATA-3’。反应在BIO-RADCFX96荧光定量PCR仪(BIO—RAD,美国)上进行,反应体系为cDNA模板(50mg/uL)2.0uL、上下游引物(10umol/L)各1uL、SYBR@Prenlix Ex TaqⅡ12.5uL和dH2O 8.5uL,每个样品3个重复。反应程序为95℃ 30s;95 qC 5 s,60 qC 30 s(single),共40个循环;95℃ 1s,65℃15s,95℃(conti’nuous),溶解曲线测定;40℃ 30s。 2.结果与分析
2.1GGT的cDNA克隆
根据cDNA文库所获得序列开放阅读框设计特异性引物,以总RNA反转录得到的cDNA为模板,通过PCR扩增到600bp左右GGT的cDNA(图1)。经测序验证与EST片段序列一致,说明EST拼接序列结果正确。EST拼接测序得到一个长944 bp的序列,在NCBI进行BLASTx对测序结果进行同源性分析,与ganlnla-glutanlyhranspeptidase(Rhizoctonia-lani AG-3 RhslAP)有85%的同源性。利用NCBI站点的ORF finder进行6种可能的框架分析,发现该cDNA片段有一个完整的开放阅读框,最长的阅读框为110-802,长度为693bp,编码230个氨基酸(图2)。
2.2同源性分析
根据GGT氨基酸序列,采用BLASTX在NCBI上进行比对,下载了17条GGT同源序列,运用Mega 4.0软件构建系统进化树,结果显示克隆GGT与立枯丝核菌AG-3融合群同源性最近(图3)。
2.3GGT在侵染各个时期表达差异分析
利用实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术,以立枯丝核菌GAPDH为内参,分析了GGT在立枯丝核菌不同侵染时间点(O、12、18、24、30、42、54、72 h)的表达情况。结果表明,GGT在立枯丝核菌侵染的各个时间点均有表达,但表达量存在明显差异,在侵染12、18h时可能由于玉米自身防卫反应,GGT表达量明显下调;而在24 h,GGT的表达量达到最高,可能是立枯丝核菌在寄主组织内迅速扩展,导致玉米叶片细胞开始程序性死亡,GGT的表达量达到最大;侵染54、72h表达量下降到相对平稳状态,可能是由于寄主大面积凋亡,病原与寄主互作概率减少造成的(图4)。
3.讨论
GGT是谷氨酰循环中的关键酶,可特异性催化y-谷氨酰基的转移反应。GGT具有诱导细胞凋亡的活性,目前被广泛接受的观点是线粒体在凋亡的调节中起到了关键的作用。GGT对细胞的基本功能是线粒体结构的维护,对膜的完整性及细胞分化和发育具有影响。GGT在真菌、植物细胞中代谢作用一直被忽略。在哺乳动物系统中,该酶已被反复使用,涉及谷胱甘肽重要的抗氧化响应功能,并与半胱氨酸输送到组织中。敲除GGT活性基因的小鼠有异常发育和早期死亡。为了进一步弄清Rhizoctonia solani GGT在细胞凋亡中的作用及探索Rhizoctonia solani的侵染机制。本试验采用RT—PCR、基因克隆和核酸测序技术首次获得R.solaniAG-IlA的GGT核酸序列,验证了前期EST序列测序的结果,EST拼接测序得到一个长944bp的序列,开放阅读框为110~802,长度为693 bp,编码230个氨基酸。相对分子量24.7ku,理论等电点4.68。为后续的功能研究、蛋白制备及其抗体研制提供了良好的试验材料。
经序列比对结果显示,本研究克隆得到的GGT与Rhizoc-tonga solani AG-3 RhslAP的GGT氨基酸同源性最高,达到85%;系统发育树构建结果显示与立枯丝核菌AG-3融合群同源性最近。后期利用real-time PCR分析GGT在立枯丝核菌侵染玉米叶片各个时间点的表达特性,表明GGT在立枯丝核菌侵染的各个时间点均有表达,但表达量存在明显差异,其中在病菌侵染玉米叶片24h时表达量最高。本研究只对玉米纹枯病菌y-谷氨酰转肽酶基因(GGT)进行了克隆,对病菌侵染玉米叶片不同时期的表达量进行了分析。GGT是否参与致病,还需进一步研究。