以痘苗病毒为载体的溶瘤病毒作为癌症治疗的新方向效果显著。同时,痘苗病毒还可以作为疫苗载体抵抗HIV、H5N1等病毒感染。因技术限制,重组痘苗病毒主要通过同源重组的方法获得,但此方法获得重组病毒的效率较低。随着CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9技术成功应用于多种动物、组织和细胞的基因编辑中,本研究拟利用CRISPR-Cas9技术建立高效重组痘苗载体系统。本研究首先构建了三个靶向痘苗病毒天坛株TK区的gRNA-Cas9的质粒以及重组质粒pJ2R-EGFP,通过瞬时转染gRNA-Cas9或建立gRNA-Cas9稳定细胞系后,导入重组质粒pJ2R-EGFP并感染VTT,获得表达EGFP的重组病毒。此高效重组痘苗病毒载体系统的重组效率比传统的同源重组方法大大提高。因此,本研究建立的高效痘苗病毒载体重组系统,为其在疫苗载体构建、肿瘤免疫治疗等方面提供参考价值。