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摘要 [目的]筛选对咪草烟具有降解作用的高效乡土菌株。[方法]对采自黑龙江省哈尔滨市郊区的对咪草烟具有降解作用的多种菌株进行了分离、筛选及鉴定。[结果]筛选得到3株菌： CX白、CX红和CX黄，其降解率分别为 58.98%、38.82% 和13.19%，其中降解效果最好的CX白属于革兰氏阳性的芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。[结论]为咪草烟高效降解菌的田间实际应用和产业化生产提供了参考。
关键词 咪草烟；降解菌；高效液相色谱；鉴定
中图分类号 S482.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）20-06707-02
Screening and Identification of One Efficient Imazethapyrdegrading Bacterium
BAO Yongming，DONG Airong et al
（Northeast Forestry University，Harbin， Heilongjiang 150040）
Abstract [Objective] The aim was to screen one efficient imazethapyrdegrading bacterium. [Method] Some imazethapyrdegrading bacterium strains which were collected from Harbin suburb of Heilongjiang were isolated， screened and identified. [Result] Three degradation strains were selected， containing CXwhite， CXred and CXyellow. The degradation rates of CXwhite， CXred and CXyellow were 58.98%， 38.82% and 13.19%， respectively. Using the DNAExtracted kit， the DNA of CXwhite were extracted and amplified by PCR. The CXwhite which could degrade imazethapyr efficiently belonged to Bacillus sp. [Conclusion] The research results lay theoretical basis for field application and industrial production of imazethapyrdegrading bacterium.
Key words Imazethapyr；Degrading bacteria；HPLC；Identification
除草剂咪草烟因具杀草谱广、活性高、选择性强等特点，是我国大豆产区用于杂草防治的重要农药。咪草烟在土壤中半衰期长，自然降解缓慢[1]，随着使用年限的增加，残留咪草烟会污染农田土壤，对后茬敏感作物产生药害，并导致大豆田轮作困难。此外，残留咪草烟还可通过雨水渗透，对农田周围水源造成污染，经食物链富集，亦可对人和其他哺乳动物的健康构成潜在危害[2]。目前全国大豆每年种植面积近700万hm2，其中黑龙江省大豆种植面积约占全国的60%，因而咪草烟使用量巨大。鉴于此，笔者分离并鉴定了对咪草烟具有降解作用的高效乡土菌株，以期填补该领域的空白并为后续田间实际应用和产业化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基。
基础培养基：硝酸铵1.00 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.50 g，硫酸铵0.50 g，磷酸二氢钾0.50 g，酵母膏0.05 g，磷酸氢二钾1.50 g，水1 L，pH 7.0。
富集培养基：蛋白胨10.0 g，氯化钠1.00 g，磷酸氢二钾1.00 g，水1 L，葡萄糖1.00 g，pH 7.0。
Tonomura无碳培养基：硫酸铵1.00 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.50 g，磷酸氢二钾1.50 g，硝酸钠1.00 g，氯化钙0.05 g，硫酸亚铁0.02 g，水1 L。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.00 g，蛋白胨10.00 g，琼脂20.00 g，氯化钠5.00 g，水1 L，pH 7.0～7.2。
1.1.2 药剂与试剂。
500 ml 5%咪草烟水剂（豆施乐）；咪草烟原药（纯度99.99%）；DV810A细菌DNA提取试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]；Quick Taq HS DyeMix PCR试剂（广东广州美津生物技术有限公司）；溶菌酶（100 mg/L）Rnase。
1.2 方法
1.2.1 土样的采集。
采用生物学统计法[3]。在黑龙江省哈尔滨市郊区的大豆和玉米田地进行多点随机取样，共采取土样5份，用无菌聚乙烯膜袋保存样品，在-4 ℃冰箱保存。
1.2.2 菌株的分离和驯化。
分别称取待测土样10.00 g，经 105 ℃ 烘干 8 min，置于干燥器中，待冷却后称质量，计算土壤含水量。称取相当于 10.00 g 干土的湿土，加入盛有 90 ml富集培养基的250 ml三角瓶中，加咪草烟至100 mg/L，置于 30 ℃、180 r/min摇床培养24 h。移取培养液10 ml接入90 ml新鲜富集培养基，提高咪草烟至200 mg/L，置于 30 ℃、180 r/min摇床培養24 h。上述步骤循环操作[4]，直至咪草烟浓度为500 mg/L。将培养液接入分离培养基（咪草烟浓度为500 mg/L，无碳源），继续培养7 d，之后用基础培养基，每隔7 d移种1次，咪草烟浓度仍为500 mg/L，14 d后再将富集所得菌液用平板划线纯化[5]，保存对咪草烟有降解作用的细菌。
关键词 咪草烟；降解菌；高效液相色谱；鉴定
中图分类号 S482.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）20-06707-02
Screening and Identification of One Efficient Imazethapyrdegrading Bacterium
BAO Yongming，DONG Airong et al
（Northeast Forestry University，Harbin， Heilongjiang 150040）
Abstract [Objective] The aim was to screen one efficient imazethapyrdegrading bacterium. [Method] Some imazethapyrdegrading bacterium strains which were collected from Harbin suburb of Heilongjiang were isolated， screened and identified. [Result] Three degradation strains were selected， containing CXwhite， CXred and CXyellow. The degradation rates of CXwhite， CXred and CXyellow were 58.98%， 38.82% and 13.19%， respectively. Using the DNAExtracted kit， the DNA of CXwhite were extracted and amplified by PCR. The CXwhite which could degrade imazethapyr efficiently belonged to Bacillus sp. [Conclusion] The research results lay theoretical basis for field application and industrial production of imazethapyrdegrading bacterium.
Key words Imazethapyr；Degrading bacteria；HPLC；Identification
除草剂咪草烟因具杀草谱广、活性高、选择性强等特点，是我国大豆产区用于杂草防治的重要农药。咪草烟在土壤中半衰期长，自然降解缓慢[1]，随着使用年限的增加，残留咪草烟会污染农田土壤，对后茬敏感作物产生药害，并导致大豆田轮作困难。此外，残留咪草烟还可通过雨水渗透，对农田周围水源造成污染，经食物链富集，亦可对人和其他哺乳动物的健康构成潜在危害[2]。目前全国大豆每年种植面积近700万hm2，其中黑龙江省大豆种植面积约占全国的60%，因而咪草烟使用量巨大。鉴于此，笔者分离并鉴定了对咪草烟具有降解作用的高效乡土菌株，以期填补该领域的空白并为后续田间实际应用和产业化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基。
基础培养基：硝酸铵1.00 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.50 g，硫酸铵0.50 g，磷酸二氢钾0.50 g，酵母膏0.05 g，磷酸氢二钾1.50 g，水1 L，pH 7.0。
富集培养基：蛋白胨10.0 g，氯化钠1.00 g，磷酸氢二钾1.00 g，水1 L，葡萄糖1.00 g，pH 7.0。
Tonomura无碳培养基：硫酸铵1.00 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.50 g，磷酸氢二钾1.50 g，硝酸钠1.00 g，氯化钙0.05 g，硫酸亚铁0.02 g，水1 L。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.00 g，蛋白胨10.00 g，琼脂20.00 g，氯化钠5.00 g，水1 L，pH 7.0～7.2。
1.1.2 药剂与试剂。
500 ml 5%咪草烟水剂（豆施乐）；咪草烟原药（纯度99.99%）；DV810A细菌DNA提取试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]；Quick Taq HS DyeMix PCR试剂（广东广州美津生物技术有限公司）；溶菌酶（100 mg/L）Rnase。
1.2 方法
1.2.1 土样的采集。
采用生物学统计法[3]。在黑龙江省哈尔滨市郊区的大豆和玉米田地进行多点随机取样，共采取土样5份，用无菌聚乙烯膜袋保存样品，在-4 ℃冰箱保存。
1.2.2 菌株的分离和驯化。
分别称取待测土样10.00 g，经 105 ℃ 烘干 8 min，置于干燥器中，待冷却后称质量，计算土壤含水量。称取相当于 10.00 g 干土的湿土，加入盛有 90 ml富集培养基的250 ml三角瓶中，加咪草烟至100 mg/L，置于 30 ℃、180 r/min摇床培养24 h。移取培养液10 ml接入90 ml新鲜富集培养基，提高咪草烟至200 mg/L，置于 30 ℃、180 r/min摇床培養24 h。上述步骤循环操作[4]，直至咪草烟浓度为500 mg/L。将培养液接入分离培养基（咪草烟浓度为500 mg/L，无碳源），继续培养7 d，之后用基础培养基，每隔7 d移种1次，咪草烟浓度仍为500 mg/L，14 d后再将富集所得菌液用平板划线纯化[5]，保存对咪草烟有降解作用的细菌。