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摘要:以PNPG为底物,α-葡萄糖苷酶为靶标,对48味常用中药进行筛选,找出降糖活性最高的中药作为研究对象,提取其活性单体,以期带动我国中药的产业化发展。
关键词:α-葡萄糖苷酶;抑制剂;高通量药物筛选;中药
中图分类号:R977.1+5文献标识码:A
文章编号:1674-0432(2010)-05-0138-2
一、材料
(一)药材
实验药材购自北碚万和大药房, 经中药师王安珍鉴定):知母、黄精、桔梗、熟地黄、生地黄、木香、麦芽、银耳、牛膝、肉桂、三七、女贞子、麦冬、泽泻、大黄、山药、赤芍、葫芦芭、淫羊藿、苍术、白芍(热)、黄芪、白术、丹参、人参、枇杷叶、五加皮、桑白皮、牛蒡子、菟丝子、石斛、夏枯草、葛根、枸杞、乌梅、地骨皮、黑芝麻、茯苓、牛膝、灵芝、仙茅、藕节、玉竹、薏苡仁、昆布、刺五加、刺五加,共计48种。
(二)主要试剂
α-葡萄糖苷酶(实验室自制),还原型谷胱甘肽(Sigma公司),4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG) (Sigma公司)。
(三)主要实验仪器
RE-52AA旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;Hitachi U-1800型紫外分光光度计,日本Hitachi仪器公司;CS1013电热鼓风干燥箱,中国重庆实验设备厂,上海福玛实验设备有限公司。
二、实验方法
(一)体外α-葡萄糖苷酶抑制活力的测定
在Matsui法基础上进行改进:取pH6.8磷酸盐缓冲液2010uL,适待测样品溶液250uL, 3mmol/L的谷胱甘肽80uL和实验室提取的α-葡萄糖苷酶各80uL于4mL的离心管中,在37℃恒温水浴中反应10min后,将反应液倒入比色皿中,加入80uL硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG),于400nm处测定在酶的作用下释放出对硝基苯酚pNP的量,不加待测品溶液作为空白对照,每两分钟读一次吸光度值并记录。每个样品同时做3个平行,取平均值,然后做吸光度随时间变化的关系曲线,可以发现吸光度与时间成正比例关系。取斜率K值,
计算个组分抑制率。
抑制率 =(K空白-K样品组)/K空白
(二)中药抑制剂的制备
称取中药20g,与50℃干燥箱中干燥之后,粉碎,过200目筛,称取5g粉碎了的中药,以1:10的固液比加入50mL工业酒精,超声波提取三次,合并提取液,减压回收溶剂,得中药浸膏,待浸膏干燥后,用1%的吐温80溶解,配制成浓度为0.1kg(原药)/L中药抑制剂溶液,放于4℃冰箱中备用。
(三)实验结果
表1:各抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制率
从图1中我们可以看出,不同的中药,对α-葡萄糖苷酶抑制活性具有显著性差异,其抑制率在50%以上的有十二个,其中以知母的抑制率最高,抑制率高达78.6%,而一些常用降血糖中药根据本实验的方法测定出对α-葡萄糖苷酶没有抑制活性,说明这些降糖中药的降糖机理不是通过对α-葡萄糖苷酶的抑制而达到降糖效果的,还有极少部分的中药测定出其抑制率为负值,估计是在反应中促进了α-葡萄糖苷酶的活性,加速了pNPG的水解,其具体机理还有待考证。
三、小节
α-葡萄糖苷酶抑制剂已被第三次亚太地区糖尿病治疗药物指南推荐为降餐后血糖的一线药物,现在临床上使用的是市售的阿卡波糖和二甲双胍等西药。这一类药物具有见效快、疗效好等特点,但随着临床应用不断深入研究发现,这类药物所引发的毒副作用也越来越引起人们的重视,糖尿病做为一种需长期用药的病症,人们对药物的安全性要求就更高。寻找疗效好,毒副作用小的降糖中药,已经成为一个迫在眉睫的问题。而中国传统应用的中药,具有悠久的使用历史,具有毒副作用小、药效稳定和标本兼治等优势,但是因为其治病机理不明确,药物成分不清楚等问题,在国际上一直没能得到重用。而随着科学技术的发展,提取及鉴定手段的提高,从中药筛选出活性好的降血糖类药物,进而提取纯化其活性单体,已经成为现代医药研究的一个重点和热点。因此,本实验从传统中药中筛选活性好的中药,以寻找新的疗效好、毒性小的降糖单体是具有很重要的意义。
参考文献
[1]Matsui T,Ueda T,Oki T.a-Glucosidase inhibitory action of natural acylated anthocyanins 1. survey of natural pigments with potent inhibitory activity [J].J Agric Food Chem,2001.
[2]王靖,葛盛芳,陈琦等.知母多糖降血糖活性研究[J].中草药,1996.
[3]黄芳,徐丽华,郭建明,等,知母提取物的降血糖作用[J].中国生化药物杂志,2005.
[4]杨军衡,曾雷,易诚,等.中药知母新皂甙成分的研究[J].天然产物研究与开发,2001.
[5]N kashima N,Kimura I,Kimura M. Isolation of pseudoprototimo-saponin AIII f rom rhizomes of Anemarrhena asphodeloides and its hypoglycemic activity in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Nat Prod ,1993.
[5]Pierre C,Roland R,Tremblay D,eta.l P-Nitrophenol-α-glucopyramoside as substrate for measurement of maltase activityin human semen[J].JClinChem,1978.
作者简介:蓝萍(1983-),女,重庆铜梁人,西南大学药学院药用资源研究所在读硕士研究生,研究方向:药用资源化学。
关键词:α-葡萄糖苷酶;抑制剂;高通量药物筛选;中药
中图分类号:R977.1+5文献标识码:A
文章编号:1674-0432(2010)-05-0138-2
一、材料
(一)药材
实验药材购自北碚万和大药房, 经中药师王安珍鉴定):知母、黄精、桔梗、熟地黄、生地黄、木香、麦芽、银耳、牛膝、肉桂、三七、女贞子、麦冬、泽泻、大黄、山药、赤芍、葫芦芭、淫羊藿、苍术、白芍(热)、黄芪、白术、丹参、人参、枇杷叶、五加皮、桑白皮、牛蒡子、菟丝子、石斛、夏枯草、葛根、枸杞、乌梅、地骨皮、黑芝麻、茯苓、牛膝、灵芝、仙茅、藕节、玉竹、薏苡仁、昆布、刺五加、刺五加,共计48种。
(二)主要试剂
α-葡萄糖苷酶(实验室自制),还原型谷胱甘肽(Sigma公司),4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG) (Sigma公司)。
(三)主要实验仪器
RE-52AA旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;Hitachi U-1800型紫外分光光度计,日本Hitachi仪器公司;CS1013电热鼓风干燥箱,中国重庆实验设备厂,上海福玛实验设备有限公司。
二、实验方法
(一)体外α-葡萄糖苷酶抑制活力的测定
在Matsui法基础上进行改进:取pH6.8磷酸盐缓冲液2010uL,适待测样品溶液250uL, 3mmol/L的谷胱甘肽80uL和实验室提取的α-葡萄糖苷酶各80uL于4mL的离心管中,在37℃恒温水浴中反应10min后,将反应液倒入比色皿中,加入80uL硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG),于400nm处测定在酶的作用下释放出对硝基苯酚pNP的量,不加待测品溶液作为空白对照,每两分钟读一次吸光度值并记录。每个样品同时做3个平行,取平均值,然后做吸光度随时间变化的关系曲线,可以发现吸光度与时间成正比例关系。取斜率K值,
计算个组分抑制率。
抑制率 =(K空白-K样品组)/K空白
(二)中药抑制剂的制备
称取中药20g,与50℃干燥箱中干燥之后,粉碎,过200目筛,称取5g粉碎了的中药,以1:10的固液比加入50mL工业酒精,超声波提取三次,合并提取液,减压回收溶剂,得中药浸膏,待浸膏干燥后,用1%的吐温80溶解,配制成浓度为0.1kg(原药)/L中药抑制剂溶液,放于4℃冰箱中备用。
(三)实验结果
表1:各抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制率
从图1中我们可以看出,不同的中药,对α-葡萄糖苷酶抑制活性具有显著性差异,其抑制率在50%以上的有十二个,其中以知母的抑制率最高,抑制率高达78.6%,而一些常用降血糖中药根据本实验的方法测定出对α-葡萄糖苷酶没有抑制活性,说明这些降糖中药的降糖机理不是通过对α-葡萄糖苷酶的抑制而达到降糖效果的,还有极少部分的中药测定出其抑制率为负值,估计是在反应中促进了α-葡萄糖苷酶的活性,加速了pNPG的水解,其具体机理还有待考证。
三、小节
α-葡萄糖苷酶抑制剂已被第三次亚太地区糖尿病治疗药物指南推荐为降餐后血糖的一线药物,现在临床上使用的是市售的阿卡波糖和二甲双胍等西药。这一类药物具有见效快、疗效好等特点,但随着临床应用不断深入研究发现,这类药物所引发的毒副作用也越来越引起人们的重视,糖尿病做为一种需长期用药的病症,人们对药物的安全性要求就更高。寻找疗效好,毒副作用小的降糖中药,已经成为一个迫在眉睫的问题。而中国传统应用的中药,具有悠久的使用历史,具有毒副作用小、药效稳定和标本兼治等优势,但是因为其治病机理不明确,药物成分不清楚等问题,在国际上一直没能得到重用。而随着科学技术的发展,提取及鉴定手段的提高,从中药筛选出活性好的降血糖类药物,进而提取纯化其活性单体,已经成为现代医药研究的一个重点和热点。因此,本实验从传统中药中筛选活性好的中药,以寻找新的疗效好、毒性小的降糖单体是具有很重要的意义。
参考文献
[1]Matsui T,Ueda T,Oki T.a-Glucosidase inhibitory action of natural acylated anthocyanins 1. survey of natural pigments with potent inhibitory activity [J].J Agric Food Chem,2001.
[2]王靖,葛盛芳,陈琦等.知母多糖降血糖活性研究[J].中草药,1996.
[3]黄芳,徐丽华,郭建明,等,知母提取物的降血糖作用[J].中国生化药物杂志,2005.
[4]杨军衡,曾雷,易诚,等.中药知母新皂甙成分的研究[J].天然产物研究与开发,2001.
[5]N kashima N,Kimura I,Kimura M. Isolation of pseudoprototimo-saponin AIII f rom rhizomes of Anemarrhena asphodeloides and its hypoglycemic activity in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Nat Prod ,1993.
[5]Pierre C,Roland R,Tremblay D,eta.l P-Nitrophenol-α-glucopyramoside as substrate for measurement of maltase activityin human semen[J].JClinChem,1978.
作者简介:蓝萍(1983-),女,重庆铜梁人,西南大学药学院药用资源研究所在读硕士研究生,研究方向:药用资源化学。