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摘要：为提高水产饲料细菌总数检测结果的精确度，从送检样品中获得20个样品细菌总数的检测结果，采用合并样本标准偏差的方法评定20个样品细菌总数的扩展不确定度为012。当检测结果以2次测定对数值的平均值表示时，其取值于lgA±012之间。
关键词：水产饲料；菌落总数；不确定度
DOI： 1013651/jcnkifjnykj201709002
Evaluation on the uncertainty in measuring total amount of aerobic bacteria in aquatic feed
RAO Qiuhua， LIU Lanying， HE Xiaoyun
（Institute of Quality Standards and Testing Technology，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fujian Province 350003）
Abstract： Measurement uncertainty is to describe the result of suspicious quantification. In order to decrease experimental error and increase the accuracy of total bacterial counting test，quantities of 20 bacterial colonies in aquatic feed were selected as samples， and the measurement uncertainty of them were tested with the method of uniting standard deviation of total samples. The results showed that the expand uncertainty was 0.12； and the value range was lgA±0.12 when expressed as the mean value of two measurements.
Key words： Aquatic feed； total numbers of colony； uncertainty
根据国家饲料卫生标准[6]的规定，鱼粉细菌总数的允许量为<2×106个（每克产品），限量饲用为 （2～5）×106 个，禁止使用的细菌总数为>5×106 个。因此，细菌总数检验结果是衡量水产饲料产品合格与否的依据之一。一直以来，检测机构是以检测值与限量标准进行比较来判定的，该方式对检测值位于限量标准左右的产品来说既不科学也不公正。目前我国参照国际标准制定和使用的《检测和校准实验室能力的通用要求》[1]标准，明确要求实验室出具的检测报告应包含相关评定校准或测试结果的不確定度说明。尽管在细菌总数检测中有诸多因素影响测量结果，例如培养条件、取样、重复性和样品保存条件等[2]，但只要在标准方法规定的条件下进行培养，样品中细菌总数的检测结果的不确定度主要取决于细菌分布的均匀性，表现为测量的重复性。现按《 饲料中细菌总数的测定》[3]的方法，对20个水产饲料样品细菌总数的测试结果进行不确定度评定的实验过程与结果报道如下。
1材料与方法
11检测样品
20份送检的水产饲料样品。
12仪器与耗材
恒温生化培养箱（30±1）℃、恒温水浴锅（46±1）℃、电子天平、振荡器、全自动高压灭菌器、营养琼脂培养基、移液枪、吸嘴、三角瓶、培养皿。
13检测过程
饶秋华等：水产饲料中细菌总数测量不确定度的评定2017年第9期2017年第9期饶秋华等：水产饲料中细菌总数测量不确定度的评定依据饲料中细菌总数测定的国家标准《 饲料中细菌总数的测定》[3]和食品菌落总数标准操作程序《2015 国家食品污染和有害因素风险监测工作手册 》[4]，用平板菌落计数法进行细菌菌落计数，具体操作步骤：在无菌操作条件下称取水产饲料样品250 g，放入含有225 mL灭菌生理盐水的无菌三角瓶中，置振荡器上充分振荡30 min后，制成1∶10的均匀稀释液；用1 mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1 mL，沿管壁慢慢注入含有9 mL灭菌生理盐水的试管中，放微型混合器上混合30 s，配制成1∶100稀释液；取1 mL灭菌吸管按上述操作顺序，配制10倍递增稀释液，如此每稀释一次更换一支1 mL灭菌吸管。
根据饲料卫生标准要求和对样品污染程度的评估，本检测室选取1×10-2、1×10-3、1×10-4三个稀释度。在作10倍递增稀释的同时，以吸管移取1 mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做2个培养皿。稀释液移入培养皿后，应及时将冷却至（46±1）℃的培养基注入培养皿，每皿约15 mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混合，从稀释样到倾注培养基的时间不能超过30 min； 待琼脂完全凝固后，倒置平皿于（30±1）℃恒温培养箱中培养（72±3）h。
14菌落计数
2次平行检测的细菌总数检测结果分别计为A1和A2，饲料样品中的细菌总数A按下式计算：
A=n×A1+A22
式中：n为样品溶液用 085%无菌生理盐水稀释的倍数。
15不确定度的评估方法
对样品细菌总数进行检测时，通常对每份样品做2个重复检测，以平均值结果出具报告，如果单凭2个数据计算标准偏差显然是不准确的。为了对具有较大的自由度的重复性标准偏差进行计算，TELARC（新西兰实验认证组织的简称）提出一种方法：用细菌总数的对数计算合并样本标准偏差[5]。《化学分析方法中不确定度的评估指南》（中国合格评定国家认可委的认可文件）的实例中详细介绍了计算标准化差值标准偏差的方法。本研究参考该方法，同时作了以下的修改：在计算中用残差代替差值。为了与对数值计算方法（TELARC法）的结果作比较，利用原始数据计算标准化残差标准差。 2结果与分析
21检测结果
22相对标准不确定度
为了得到两次重复测量平均值的相对标准不确定度，标准化残差标准差应除以2，该结果反映了总的检测程序随机变化的相对不确定度，其相对标准不确定度为：
Urel（A）=RSD（A）=008822=00624
23扩展不确定度
取包含因子k=2、置信水平约为95%，扩展不确定度为：
UREL（A）=kUrel（A）=2×00624=012
3结论与讨论
本试验采用合并样本标准偏差的方法评定20个送检样品细菌总数的扩展不确定度为012。当检测结果以2次测定对数值的平均值表示时，其取值于lgA±012之间。
本试验采用的计算方法与TELARC法在本质上是相同的，因为两者都是检测结果的相对标准不确定度，其差别仅表现为本例未将残差进行平方，而是以残差除以检测平均值得到标准化残差，本例所采用的标准化残差标准差的计算方法更简单便捷。
参考文献：
[1]刘安平，齐晓，乔东，等GB/T 27025-2008/ISO/IEC 17025：2005，檢测和校准实验室能力的通用要求[S]北京：中国标准出版社，2008
[2]朱勇食品中菌落总数测定不确定度评定的应用[J]中国卫生产业，2017（18）：41-44
[3]李丽蓓，饶正华，杨曙明，等GB/T 13093-2006，饲料中细菌总数的测定[S]北京：中国标准出版社，2007
[4]杨大进，李宁2015年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册（菌落总数标准操作程序）[S]北京：中国质检出版社，2010
[5]赵宏，赵化冰，张宏伟，等PetrifilmTM测试片法在水产品细菌总数检测中不确定度的评定[J]食品研究与开发，2009，30（6）： 133-138
[6]姚继承，艾地云，杨林，等GB 13078-2001，饲料卫生标准[S]北京：中国标准出版社，2001
（责任编辑：杨小萍）2017年第9期
收稿日期：2017-08-14
作者简介：吴仁烨，男，1983年生，博士，讲师。
*通讯作者：郑金贵，男，1949年生，博士生导师，教授（Email：jinguizheng@hotmailcom）。
关键词：水产饲料；菌落总数；不确定度
DOI： 1013651/jcnkifjnykj201709002
Evaluation on the uncertainty in measuring total amount of aerobic bacteria in aquatic feed
RAO Qiuhua， LIU Lanying， HE Xiaoyun
（Institute of Quality Standards and Testing Technology，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fujian Province 350003）
Abstract： Measurement uncertainty is to describe the result of suspicious quantification. In order to decrease experimental error and increase the accuracy of total bacterial counting test，quantities of 20 bacterial colonies in aquatic feed were selected as samples， and the measurement uncertainty of them were tested with the method of uniting standard deviation of total samples. The results showed that the expand uncertainty was 0.12； and the value range was lgA±0.12 when expressed as the mean value of two measurements.
Key words： Aquatic feed； total numbers of colony； uncertainty
根据国家饲料卫生标准[6]的规定，鱼粉细菌总数的允许量为<2×106个（每克产品），限量饲用为 （2～5）×106 个，禁止使用的细菌总数为>5×106 个。因此，细菌总数检验结果是衡量水产饲料产品合格与否的依据之一。一直以来，检测机构是以检测值与限量标准进行比较来判定的，该方式对检测值位于限量标准左右的产品来说既不科学也不公正。目前我国参照国际标准制定和使用的《检测和校准实验室能力的通用要求》[1]标准，明确要求实验室出具的检测报告应包含相关评定校准或测试结果的不確定度说明。尽管在细菌总数检测中有诸多因素影响测量结果，例如培养条件、取样、重复性和样品保存条件等[2]，但只要在标准方法规定的条件下进行培养，样品中细菌总数的检测结果的不确定度主要取决于细菌分布的均匀性，表现为测量的重复性。现按《 饲料中细菌总数的测定》[3]的方法，对20个水产饲料样品细菌总数的测试结果进行不确定度评定的实验过程与结果报道如下。
1材料与方法
11检测样品
20份送检的水产饲料样品。
12仪器与耗材
恒温生化培养箱（30±1）℃、恒温水浴锅（46±1）℃、电子天平、振荡器、全自动高压灭菌器、营养琼脂培养基、移液枪、吸嘴、三角瓶、培养皿。
13检测过程
饶秋华等：水产饲料中细菌总数测量不确定度的评定2017年第9期2017年第9期饶秋华等：水产饲料中细菌总数测量不确定度的评定依据饲料中细菌总数测定的国家标准《 饲料中细菌总数的测定》[3]和食品菌落总数标准操作程序《2015 国家食品污染和有害因素风险监测工作手册 》[4]，用平板菌落计数法进行细菌菌落计数，具体操作步骤：在无菌操作条件下称取水产饲料样品250 g，放入含有225 mL灭菌生理盐水的无菌三角瓶中，置振荡器上充分振荡30 min后，制成1∶10的均匀稀释液；用1 mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1 mL，沿管壁慢慢注入含有9 mL灭菌生理盐水的试管中，放微型混合器上混合30 s，配制成1∶100稀释液；取1 mL灭菌吸管按上述操作顺序，配制10倍递增稀释液，如此每稀释一次更换一支1 mL灭菌吸管。
根据饲料卫生标准要求和对样品污染程度的评估，本检测室选取1×10-2、1×10-3、1×10-4三个稀释度。在作10倍递增稀释的同时，以吸管移取1 mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做2个培养皿。稀释液移入培养皿后，应及时将冷却至（46±1）℃的培养基注入培养皿，每皿约15 mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混合，从稀释样到倾注培养基的时间不能超过30 min； 待琼脂完全凝固后，倒置平皿于（30±1）℃恒温培养箱中培养（72±3）h。
14菌落计数
2次平行检测的细菌总数检测结果分别计为A1和A2，饲料样品中的细菌总数A按下式计算：
A=n×A1+A22
式中：n为样品溶液用 085%无菌生理盐水稀释的倍数。
15不确定度的评估方法
对样品细菌总数进行检测时，通常对每份样品做2个重复检测，以平均值结果出具报告，如果单凭2个数据计算标准偏差显然是不准确的。为了对具有较大的自由度的重复性标准偏差进行计算，TELARC（新西兰实验认证组织的简称）提出一种方法：用细菌总数的对数计算合并样本标准偏差[5]。《化学分析方法中不确定度的评估指南》（中国合格评定国家认可委的认可文件）的实例中详细介绍了计算标准化差值标准偏差的方法。本研究参考该方法，同时作了以下的修改：在计算中用残差代替差值。为了与对数值计算方法（TELARC法）的结果作比较，利用原始数据计算标准化残差标准差。 2结果与分析
21检测结果
22相对标准不确定度
为了得到两次重复测量平均值的相对标准不确定度，标准化残差标准差应除以2，该结果反映了总的检测程序随机变化的相对不确定度，其相对标准不确定度为：
Urel（A）=RSD（A）=008822=00624
23扩展不确定度
取包含因子k=2、置信水平约为95%，扩展不确定度为：
UREL（A）=kUrel（A）=2×00624=012
3结论与讨论
本试验采用合并样本标准偏差的方法评定20个送检样品细菌总数的扩展不确定度为012。当检测结果以2次测定对数值的平均值表示时，其取值于lgA±012之间。
本试验采用的计算方法与TELARC法在本质上是相同的，因为两者都是检测结果的相对标准不确定度，其差别仅表现为本例未将残差进行平方，而是以残差除以检测平均值得到标准化残差，本例所采用的标准化残差标准差的计算方法更简单便捷。
参考文献：
[1]刘安平，齐晓，乔东，等GB/T 27025-2008/ISO/IEC 17025：2005，檢测和校准实验室能力的通用要求[S]北京：中国标准出版社，2008
[2]朱勇食品中菌落总数测定不确定度评定的应用[J]中国卫生产业，2017（18）：41-44
[3]李丽蓓，饶正华，杨曙明，等GB/T 13093-2006，饲料中细菌总数的测定[S]北京：中国标准出版社，2007
[4]杨大进，李宁2015年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册（菌落总数标准操作程序）[S]北京：中国质检出版社，2010
[5]赵宏，赵化冰，张宏伟，等PetrifilmTM测试片法在水产品细菌总数检测中不确定度的评定[J]食品研究与开发，2009，30（6）： 133-138
[6]姚继承，艾地云，杨林，等GB 13078-2001，饲料卫生标准[S]北京：中国标准出版社，2001
（责任编辑：杨小萍）2017年第9期
收稿日期：2017-08-14
作者简介：吴仁烨，男，1983年生，博士，讲师。
*通讯作者：郑金贵，男，1949年生，博士生导师，教授（Email：jinguizheng@hotmailcom）。