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摘要：本研究以21个高灌蓝莓品种为试材，克隆VcCBF基因，测序后分析其单核苷酸多态性（SNP），共克隆到123个非重复序列，发现120个SNP位点，单核苷酸多态性发生频率为1/695bp，核苷酸多态性值（Pi）为0.01251。在120个SNP位点中，单态突变位点62个；简约信息位点58个，其中双突变55个，三突变3个。对其碱基替换方式进行分析发现，转换91个，颠换26个，转换与颠换的发生比率为3.5∶1。通过单倍型分析发现，21个蓝莓品种的VcCBF基因存在5种单倍型。
关键词：CBF；单核苷酸多态性（SNP）；蓝莓
中图分类号：Q524+.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0008-03
CBF基因（也称为DREB1基因）编码一个具有AP2结构域的转录激活子，能够结合到CRT（C-repeat）或DRE（dehydration-responsive element）顺式作用元件上，调节植物冷适应相关基因的表达[1]。CBF基因是植物冷适应及信号传导领域最有意义的发现之一，多种与植物冷适应相关的基因都受其调控，目前已在多种重要的农作物及蔬菜中发现该基因[2～4]。Polashock等[5]从高灌蓝莓（Vaccinium corymbosum）品种蓝丰（Bluecrop）和兔眼蓝莓（Vaccinium virgatum） 品种梯芙蓝（Tifblue）中克隆到CBF基因并验证其功能，发现CBF基因表达量和表达模式的差异可能与品种间的抗寒性不同有关。
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指在基因组水平上由单核苷酸变异引起的一种序列多态性[6]。在所有可能的DNA序列差异性中，单核苷酸多态性是发生频率最高的变异，人类90%左右的DNA序列多态性都是单核苷酸多态性[7]。单核苷酸多态性具有数量大、分布广、稳定性强、易于分型等优点，在人类疾病的诊断及治疗、致病基因的发现、族群的演化研究等方面起到了重要作用，同时在小麦、玉米、大豆等作物的物理作图、进化研究、遗传研究中也是有效的分子标记[6， 8～11]。
本研究以21个不同品种的高灌蓝莓为材料，克隆VcCBF基因，采用直接测序法筛查其单核苷酸多态性，以期为研究VcCBF基因与蓝莓抗寒性的关系奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
本研究所用的21个高灌蓝莓品种采自山东省果树研究所蓝莓品种资源圃，分别为伯克利（Berkeley）、喜来（Sierra）、陶柔（Toro）、都克（Duke）、日出（Sunrise）、蓝丰（Bluecrop）、埃利奥特（Elliott）、达柔（Darrow）、蓝塔（Bluetta）、泽西（Jersey）、布里吉塔（Brigitta）、早蓝（Earliblue）、晚蓝（Lateblue）、蓝金（Bluegold）、瑞卡（Reka）、佐治亚宝石（Georgiagem）、密斯提（Misty）、奥尼尔（O’Neal）、夏普蓝（Sharpblue）、罗卫（Reveille）和普鲁（Puru）。
1.2VcCBF基因的克隆、测序及单核苷酸多态性分析
以蓝莓幼嫩叶片为材料，采用TIANGEN植物基因组提取试剂盒提取基因组DNA， 根据已发表的蓝莓CBF基因序列设计引物进行PCR扩增。 扩增所用上游引物为5′-GAATCGTCGATGGAATATAACT-3′，下游引物为5′-TCTAAAATCTAACTCCACAACG-3′。PCR产物回收后采用pMD18-T载体（TaKaRa公司）连接，转化DH5α感受态细胞，在含有Amp的LB平板上培养过夜后，挑取菌落进行菌落PCR筛选阳性克隆，每个品种选取8个，送上海生工生物工程有限公司测序[12]，所得序列采用DnaSP v5软件分析[13]。
2结果与分析
2.1VcCBF基因的克隆
PCR所得目的片段长度为698 bp，编码区长681 bp，将测序结果进行比对，除去重复序列，共得到123个非重复序列，每个品种有4～8个，结果见表1。
2.2VcCBF基因的单核苷酸多态性分析
将得到的123个VcCBF基因编码区非重复序列用DnaSP v5软件进行单核苷酸多态性分析，结果见表2。共发现了120个SNP位点，全部为单核苷酸替换，没有InDel的情况发生，SNP的发生频率为1/695bp，核苷酸多态性值（Pi）为0.01251。在120个SNP位点中，单态突变位点（singleton variable sites）62个，简约信息位点（parsimony informative sites）58个，简约信息位点中，双突变55个，三突变3个（表3）。
3讨论与结论
本研究通过对21个蓝莓品种VcCBF基因的克隆测序，得到123个非重复序列，测序总长度83 394 bp，在VcCBF基因编码区共发现120个多态性位点，单核苷酸多态性发生频率为1/695bp，核苷酸多态性值（Pi）为0.01251。相对于其他物种，VcCBF基因的单核苷酸多态性频率较低，这可能与其受到的选择压力较大相关。通过对120个SNP位点的具体分析，发现单态突变位点有62个，简约信息位点58个（双突变55个，三突变3个）。对碱基替换方式进行分析，发现转换有91个，颠换为26个，转换与颠换的比率为3.5∶1。进一步通过组装一致序列，进行单倍型分析，发现21个蓝莓品种中有5种单倍型。
直接测序法筛查SNP也存在不足，首先在克隆和测序过程中会造成假阳性，在检测到的62个单态突变位点中可能存在克隆或测序错误造成的误差。此外，高灌蓝莓品种为四倍体，且多为杂交选育而来，其本身VcCBF基因的情况较为复杂，本研究从每个品种筛选8个阳性克隆进行测序，可能没有涵盖所有的内源VcCBF基因，从而对分析其单核苷酸多态性和单倍型造成不足。本研究对高灌蓝莓CBF基因进行了初步分析，找到了部分VcCBF基因的单倍型，但每种单倍型对高灌蓝莓抗寒性的贡献还需进一步研究。 参考文献：
[1]Fowler S， Thomashow M F. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway[J]. Plant Cell， 2002， 14（8）：1675-1690.
[2]Thomashow M F. PLANT COLD ACCLIMATION： Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms[J]. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.， 1999， 50：571-599.
[3]刘洋洋， 郭栋，楚秀生， 等. 转DREB基因小麦新品系抗旱生理指标测定[J]. 山东农业科学， 2013， 45（3）：38-41.
[4]李利斌，刘立锋，王殿峰， 等. 大白菜CBF4基因的克隆和遗传进化分析[J]. 山东农业科学，2009，4：1-4.
[5]Polashock J J， Arora R， Peng Y， et al. Functional identification of a C-repeat binding factor transcriptional activator from blueberry associated with cold acclimation and freezing tolerance[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2010， 135（1）：40-48.
[6]Brookes A J. The essence of SNPs[J]. Gene， 1999， 234（2）：177-186.
[7]Collins F S， Brooks L D， Chakravarti A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation[J]. Genome Res.， 1998， 8（12）：1229-1231.
[8]Rafalski J A. Novel genetic mapping tools in plants： SNPs and LD-based approaches[J]. Plant Science， 2002， 162（3）：329-333.
[9]Chagne D， Gasic K， Crowhurst R N， et al. Development of a set of SNP markers present in expressed genes of the apple[J]. Genomics， 2008， 92（5）：353-358.
[10]Ganal M W， Altmann T， Roder M S. SNP identification in crop plants[J]. Curr. Opin. Plant Biol.， 2009， 12（2）：211-217.
[11]Shu Y J， Li Y， Wu N L H， et al. Mining and identification of SNPs from EST sequences in soybean and converting SNP markers into CAPS[J]. Acta Agronomica Sinica， 2010， 36（4）：574-579.
[12]臧建磊，李亚东，刘庆忠，等. 笃斯越橘CBF基因的克隆及序列分析[J]. 吉林农业大学学报， 2011， 33（5）：532-535.
[13]Librado P， Rozas J. DnaSP v5： a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics， 2009， 25（11）：1451-1452.山 东 农 业 科 学2014，46（2）：11～12，16Shandong Agricultural Sciences
关键词：CBF；单核苷酸多态性（SNP）；蓝莓
中图分类号：Q524+.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0008-03
CBF基因（也称为DREB1基因）编码一个具有AP2结构域的转录激活子，能够结合到CRT（C-repeat）或DRE（dehydration-responsive element）顺式作用元件上，调节植物冷适应相关基因的表达[1]。CBF基因是植物冷适应及信号传导领域最有意义的发现之一，多种与植物冷适应相关的基因都受其调控，目前已在多种重要的农作物及蔬菜中发现该基因[2～4]。Polashock等[5]从高灌蓝莓（Vaccinium corymbosum）品种蓝丰（Bluecrop）和兔眼蓝莓（Vaccinium virgatum） 品种梯芙蓝（Tifblue）中克隆到CBF基因并验证其功能，发现CBF基因表达量和表达模式的差异可能与品种间的抗寒性不同有关。
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指在基因组水平上由单核苷酸变异引起的一种序列多态性[6]。在所有可能的DNA序列差异性中，单核苷酸多态性是发生频率最高的变异，人类90%左右的DNA序列多态性都是单核苷酸多态性[7]。单核苷酸多态性具有数量大、分布广、稳定性强、易于分型等优点，在人类疾病的诊断及治疗、致病基因的发现、族群的演化研究等方面起到了重要作用，同时在小麦、玉米、大豆等作物的物理作图、进化研究、遗传研究中也是有效的分子标记[6， 8～11]。
本研究以21个不同品种的高灌蓝莓为材料，克隆VcCBF基因，采用直接测序法筛查其单核苷酸多态性，以期为研究VcCBF基因与蓝莓抗寒性的关系奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
本研究所用的21个高灌蓝莓品种采自山东省果树研究所蓝莓品种资源圃，分别为伯克利（Berkeley）、喜来（Sierra）、陶柔（Toro）、都克（Duke）、日出（Sunrise）、蓝丰（Bluecrop）、埃利奥特（Elliott）、达柔（Darrow）、蓝塔（Bluetta）、泽西（Jersey）、布里吉塔（Brigitta）、早蓝（Earliblue）、晚蓝（Lateblue）、蓝金（Bluegold）、瑞卡（Reka）、佐治亚宝石（Georgiagem）、密斯提（Misty）、奥尼尔（O’Neal）、夏普蓝（Sharpblue）、罗卫（Reveille）和普鲁（Puru）。
1.2VcCBF基因的克隆、测序及单核苷酸多态性分析
以蓝莓幼嫩叶片为材料，采用TIANGEN植物基因组提取试剂盒提取基因组DNA， 根据已发表的蓝莓CBF基因序列设计引物进行PCR扩增。 扩增所用上游引物为5′-GAATCGTCGATGGAATATAACT-3′，下游引物为5′-TCTAAAATCTAACTCCACAACG-3′。PCR产物回收后采用pMD18-T载体（TaKaRa公司）连接，转化DH5α感受态细胞，在含有Amp的LB平板上培养过夜后，挑取菌落进行菌落PCR筛选阳性克隆，每个品种选取8个，送上海生工生物工程有限公司测序[12]，所得序列采用DnaSP v5软件分析[13]。
2结果与分析
2.1VcCBF基因的克隆
PCR所得目的片段长度为698 bp，编码区长681 bp，将测序结果进行比对，除去重复序列，共得到123个非重复序列，每个品种有4～8个，结果见表1。
2.2VcCBF基因的单核苷酸多态性分析
将得到的123个VcCBF基因编码区非重复序列用DnaSP v5软件进行单核苷酸多态性分析，结果见表2。共发现了120个SNP位点，全部为单核苷酸替换，没有InDel的情况发生，SNP的发生频率为1/695bp，核苷酸多态性值（Pi）为0.01251。在120个SNP位点中，单态突变位点（singleton variable sites）62个，简约信息位点（parsimony informative sites）58个，简约信息位点中，双突变55个，三突变3个（表3）。
3讨论与结论
本研究通过对21个蓝莓品种VcCBF基因的克隆测序，得到123个非重复序列，测序总长度83 394 bp，在VcCBF基因编码区共发现120个多态性位点，单核苷酸多态性发生频率为1/695bp，核苷酸多态性值（Pi）为0.01251。相对于其他物种，VcCBF基因的单核苷酸多态性频率较低，这可能与其受到的选择压力较大相关。通过对120个SNP位点的具体分析，发现单态突变位点有62个，简约信息位点58个（双突变55个，三突变3个）。对碱基替换方式进行分析，发现转换有91个，颠换为26个，转换与颠换的比率为3.5∶1。进一步通过组装一致序列，进行单倍型分析，发现21个蓝莓品种中有5种单倍型。
直接测序法筛查SNP也存在不足，首先在克隆和测序过程中会造成假阳性，在检测到的62个单态突变位点中可能存在克隆或测序错误造成的误差。此外，高灌蓝莓品种为四倍体，且多为杂交选育而来，其本身VcCBF基因的情况较为复杂，本研究从每个品种筛选8个阳性克隆进行测序，可能没有涵盖所有的内源VcCBF基因，从而对分析其单核苷酸多态性和单倍型造成不足。本研究对高灌蓝莓CBF基因进行了初步分析，找到了部分VcCBF基因的单倍型，但每种单倍型对高灌蓝莓抗寒性的贡献还需进一步研究。 参考文献：
[1]Fowler S， Thomashow M F. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway[J]. Plant Cell， 2002， 14（8）：1675-1690.
[2]Thomashow M F. PLANT COLD ACCLIMATION： Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms[J]. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.， 1999， 50：571-599.
[3]刘洋洋， 郭栋，楚秀生， 等. 转DREB基因小麦新品系抗旱生理指标测定[J]. 山东农业科学， 2013， 45（3）：38-41.
[4]李利斌，刘立锋，王殿峰， 等. 大白菜CBF4基因的克隆和遗传进化分析[J]. 山东农业科学，2009，4：1-4.
[5]Polashock J J， Arora R， Peng Y， et al. Functional identification of a C-repeat binding factor transcriptional activator from blueberry associated with cold acclimation and freezing tolerance[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2010， 135（1）：40-48.
[6]Brookes A J. The essence of SNPs[J]. Gene， 1999， 234（2）：177-186.
[7]Collins F S， Brooks L D， Chakravarti A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation[J]. Genome Res.， 1998， 8（12）：1229-1231.
[8]Rafalski J A. Novel genetic mapping tools in plants： SNPs and LD-based approaches[J]. Plant Science， 2002， 162（3）：329-333.
[9]Chagne D， Gasic K， Crowhurst R N， et al. Development of a set of SNP markers present in expressed genes of the apple[J]. Genomics， 2008， 92（5）：353-358.
[10]Ganal M W， Altmann T， Roder M S. SNP identification in crop plants[J]. Curr. Opin. Plant Biol.， 2009， 12（2）：211-217.
[11]Shu Y J， Li Y， Wu N L H， et al. Mining and identification of SNPs from EST sequences in soybean and converting SNP markers into CAPS[J]. Acta Agronomica Sinica， 2010， 36（4）：574-579.
[12]臧建磊，李亚东，刘庆忠，等. 笃斯越橘CBF基因的克隆及序列分析[J]. 吉林农业大学学报， 2011， 33（5）：532-535.
[13]Librado P， Rozas J. DnaSP v5： a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics， 2009， 25（11）：1451-1452.山 东 农 业 科 学2014，46（2）：11～12，16Shandong Agricultural Sciences