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【摘 要】 糖尿病作为威胁人类健康最主要的慢性非传染性疾病，全球患者人数已经达到近4亿。其中绝大多数患者属于II型糖尿病，由于胰岛素分泌量不足需要接受日常药物治疗。然而现有的降血糖药需要患者每日多次地注射针剂，这给患者带来了从肉体到精神上的痛苦和烦恼。本创意旨在避免这种日复一日的繁复针剂注射，核心是利用腸道益生菌作为表达降血糖蛋白药物的载体。肠道益生菌选用地衣芽孢杆菌，它可以在肠道定植且长期繁衍;通过基因工程的手段转入降血糖药物利拉鲁肽基因，形成转基因益生菌;人工诱导使该菌转换为能抵抗极端环境的孢子形态，既制成新型降糖药物。该药物口服，孢子可以顺利通过胃液到达肠道，在肠道萌发成为转基因益生菌，该菌产生并分泌降糖药利拉鲁肽，被小肠绒毛吸收进入血液而产生降血糖作用。本创意由于口服而没有注射的痛苦，由于可长期发挥作用而没有繁复给药的羁绊，为糖尿病患者带来品质生活的福音。
研究背景
1 糖尿病
糖尿病是当前威胁全球人类健康最主要的慢性非传染性疾病之一。糖尿病是由遗传和环境因素共同作用于机体而导致的体内胰岛素分泌不足或者胰岛素抵抗而引发体内糖、脂质、蛋白质等发生代谢紊乱的疾病，临床上以高血糖为主要表现。持续的高血糖与长期的代谢紊乱现象可导致全身组织器官，特别是眼、肾、心血管及神经系统的损害及其功能障碍和衰竭。
2013年国际糖尿病联盟（IDF）最新统计报告（http：//www.idf.org/diabetesatlas）显示，全球3.82亿糖尿病患者，而且患病率仍在持续上升，预计在2035年全球患者数将达到5.92亿，如何遏制糖尿病发病持续增长的趋势已经成为全球性健康课题。在我国，糖尿病发病形势尤为严峻，目前已有超过全球发病人数1/4的糖尿病患者（近1亿人口），给个人、家庭、社会和国家带来了沉重的经济负担[1]。
糖尿病在临床上分为I型糖尿病和II型糖尿病。I型糖尿病，又称为胰岛素依赖型糖尿病（Insulin Dependent Diabetes Mellitus ，IDDM），一般是由于自身免疫系统攻击胰岛β细胞（分泌胰岛素的细胞）所导致的，β细胞被严重损害或完全缺失，导致胰岛素的内源性分泌极低;临床表现为高血糖、高尿糖、糖耐量受损，同时伴随着胰岛素的异常释放，是一种遗传性疾病;因此必须要外源注射胰岛素制剂对机体的血糖水平进行调控。I型糖尿病多发病于儿童或青少年时期，但也有极少数的老年病例。
II型糖尿病，又称为非胰岛素依赖型糖尿病（Noninsulin-Dependent Diabetes Mellitus，NIDDM），相较于I型糖尿病而言，II型糖尿病的发病机理更加复杂，基因与环境因素均能影响II型糖尿病的发生。糖尿病患者中90%以上的人群均属于II型糖尿病，多发病于成年人群，早期症状不明显，病人多肥胖。
II型糖尿病的初始阶段是由于机体的靶细胞对胰岛素产生耐受而引起，从而促使胰岛β细胞产生更多的胰岛素，进而产生胰岛素抵抗效应。在此阶段机体不会表现出高血糖症状，但临床表现为高胰岛素，又称为高胰岛素血症（hyperinsulinemia）。而胰岛β细胞长期处于一种兴奋阶段，导致胰岛β细胞的功能开始衰竭，在此阶段，胰岛β细胞开始凋亡，进而导致胰岛素分泌不足，机体出现高血糖症状从而表现为II型糖尿病。目前普遍认为II型糖尿病是胰岛素相对不足和外周组织对胰岛素不敏感（胰岛素抵抗）所导致的，其真正的致病机理仍有待进一步研究[2]。
2 糖尿病的治疗
胰岛素制剂有动物胰岛素、人胰岛素和胰岛素类似物。根据作用时间分为短效、中效和长效胰岛素，并已制成混合制剂，如诺和灵30R，优泌林70/30。
1型糖尿病需要用胰岛素治疗。非强化治疗者每天注射2～3次，强化治疗者每日注射3～4次，或用胰岛素泵治疗。需经常调整剂量[3]。
2型糖尿病，口服降糖药失效者先采用联合治疗方式，方法为原用口服降糖药剂量不变，睡前晚10∶00注射中效胰岛素或长效胰岛素类似物，一般每隔3天调整1次，目的为空腹血糖降到4.9～8.0毫摩尔/升，无效者停用口服降糖药，改为每天注射2次胰岛素[4]。
胰岛素治疗的最大不良反应为低血糖。
3 常规疗法的弊端
目前无论哪种类型糖尿病，多数人需要每天注射1-4次胰岛素或相关药物。然而每日多次注射药物给糖尿病患者带来了无尽的苦恼[5]！
所以当今社会亟需既缓释的糖尿病药物和无创的给药方法，用以改善全球近4亿糖尿病患者的生活品质！
原理
是否可以设计一种长效的口服糖尿病药物呢？这种药物需要满足两个要求：
（1）要持久，免去糖尿病人每日几针之苦和高昂的费用。需要长效地缓释型或分泌型药物！
（2）用口服剂型改变注射的痛苦。现有的口服药物大多在胃里被分解，吸收差。需要可以顺利通过胃液的剂型！
经过长期的课外思考，一个灵感如穿透密布乌云的一缕阳光般电到了我——通过基因工程手段让肠道益生菌表达降糖活性蛋白！这个创意的核心是：
（1）解决长效的问题：肠道益生菌可在肠道内长期存活并繁衍，由肠道益生菌表达蛋白药物，可以长期持续地分泌药物使肠道吸收进入血液！
（2）解决口服药通过胃液的问题：益生菌的孢子形态能抵抗极端环境，可顺利通过胃液[6]！
（3）基因工程手段可以将编码降糖活性蛋白的基因导入到益生菌中，使其表达蛋白药物。
创新点
（1）借助肠道益生菌载体表达降糖蛋白药物，分泌后经肠道吸收，可实现长效地供药目的。
（2）借助益生菌的孢子形态能抵抗极端环境，可顺利通过胃液，可实现口服给药的目的。 （3）借助基因工程手段将降糖蛋白基因导入益生菌，产生分泌降糖药物的益生菌。
主要内容
该创意分为4部分的设计：益生菌的选择、降血糖药物基因的选择、基因工程方法、益生菌孢子的制备等。
（1）益生菌的选择
本创意选择了地衣芽孢杆菌（如图1），它属于革兰氏阳性细菌。对人来讲可以作为肠道益生菌，可在肠道中长期定殖并排斥有害细菌。它的生活周期为，条件适宜时可以生长和出芽繁殖，条件不适宜时则形成孢子，孢子具有致密的保护层，耐酸碱等极端环境，等待条件适宜的时候萌发，并继续生活周期（如图2）。所以地衣芽孢杆菌的孢子形态可以有效地抵抗胃液的低pH环境，而肠道的环境适宜孢子萌发和成体菌的生存[7]。
图1 地衣芽孢杆菌的形态
图2 地衣芽孢杆菌的生活周期
（2）降血糖药物基因的选择
本创意选择了利拉鲁肽（Liraglutide），长31个氨基酸（序列和结构见图3），是一种GLP-1（胰高血糖素样肽-1）类似物，是一种内源性肠促胰岛素激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素[8，9]。
利拉鲁肽能够以葡萄糖浓度依赖的模式刺激胰岛素的分泌，同时以葡萄糖浓度依赖的模式降低过高的胰高糖素的分泌。因此，当血糖升高时，胰岛素分泌受到刺激，同时胰高糖素分泌受到抑制。与之相反，在低血糖时利拉鲁肽能够减少胰岛素分泌，且不影响胰高糖素的分泌。利拉鲁肽能够通过减轻饥饿感和能量摄入降低体重和体脂量。利拉鲁肽作为一个2型糖尿病的治疗药物，于2010年在美国与欧洲上市[10]。
图3 利拉鲁肽的氨基酸序列（左）和分子结构（右）
4 基因工程方法
本创意将利拉鲁肽的编码基因（含93个碱基的核酸）构建到原核细胞表达质粒上，经过质粒转化导入到地衣芽孢杆菌中，由于该质粒具有原核细胞表达所需的原件，故可在地衣芽孢杆菌中表達并分泌利拉鲁肽。
5 益生菌孢子的制备
细菌形态的地衣芽孢杆菌遇到胃液是很难存活的，一定要先制备成孢子。人工模拟培养环境如温度、湿度、酸碱度、盐离子等条件使转基因的地衣芽孢杆菌形成孢子，将孢子冻干制成药物即为本创意的最终产品。
食用孢子，孢子可以无损地通过胃液，在肠道内萌发、繁殖成转基因益生菌。这种益生菌能表达利拉鲁肽，经肠粘膜上皮细胞吸收入血，刺激胰岛素的分泌，治疗2型糖尿病。
应用价值
全球有近4亿的糖尿病患者，其中大部分是2型。他们需要终身每日注射多支降血糖药物，既承受了巨大的身心痛苦，又需付出极高的经济成本。
本创意旨在开发一种以益生菌为载体的新型长效的口服糖尿病药物，如果实现将从两方面给广大糖尿病患者带来福音：1、多天甚至1个月用一次药物，将患者从繁琐的用药程序里解脱出来;2、用药形式为口服，免去了患者注射药物的痛苦和感染的风险，加大地提高生活品质。
参考文献
[1].中国人群糖尿病疾病负担的系统评价;周海龙，杨晓妍，潘晓平，卢文学，刘祥，周欢;中国循证医学杂志;2014;14 （12）： 1442～1449。
[2].中国2型糖尿病防治指南（2013年版）;中华糖尿病杂志;2014;6 （7）： 447-498。
[3].糖尿病治疗药物的研究进展;贺星，田红，徐颂，李艳凤，陈常青;现代药物与临床;2009;24（3 ）：129-133。
[4].2型糖尿病患者的药物治疗和健康教育;吴荔嘉，林碧英，谢根英;当代医学;2011; 17（22）：43-44。
[5].糖尿病治疗药物——胰岛素研究进展;饶建华，陈廷胜，禹腾波;中国实用医药;2009;4（29）：220-222。
[6].益生菌的分类、生理功能与有效性评价研究进展;李军训，罗学刚，高洁，郝冉，张同存;中国农业科技导报;201 0;12（ 6） ： 49- 55。
[7].饲用地衣芽孢杆菌的生物学特性研究;董尚智，王国霞，陈远凤，程萍;饲料研究;2009;7：14-18.
[8].利拉鲁肽临床研究进展;陈群峰，王永祥;世界临床药物;2013; 34（5）：312-315。
[9].胰岛素及其类似物的研究进展;张春云，蔡永明，张骏，王海荣，张宗鹏;药物评价研究;2010;33（6）：436-441。
[10].利拉鲁肽用于治疗2型糖尿病临床研究现状;陈忻，翟所迪;中国药学杂志;2011;46（21）：1685-1687。
研究背景
1 糖尿病
糖尿病是当前威胁全球人类健康最主要的慢性非传染性疾病之一。糖尿病是由遗传和环境因素共同作用于机体而导致的体内胰岛素分泌不足或者胰岛素抵抗而引发体内糖、脂质、蛋白质等发生代谢紊乱的疾病，临床上以高血糖为主要表现。持续的高血糖与长期的代谢紊乱现象可导致全身组织器官，特别是眼、肾、心血管及神经系统的损害及其功能障碍和衰竭。
2013年国际糖尿病联盟（IDF）最新统计报告（http：//www.idf.org/diabetesatlas）显示，全球3.82亿糖尿病患者，而且患病率仍在持续上升，预计在2035年全球患者数将达到5.92亿，如何遏制糖尿病发病持续增长的趋势已经成为全球性健康课题。在我国，糖尿病发病形势尤为严峻，目前已有超过全球发病人数1/4的糖尿病患者（近1亿人口），给个人、家庭、社会和国家带来了沉重的经济负担[1]。
糖尿病在临床上分为I型糖尿病和II型糖尿病。I型糖尿病，又称为胰岛素依赖型糖尿病（Insulin Dependent Diabetes Mellitus ，IDDM），一般是由于自身免疫系统攻击胰岛β细胞（分泌胰岛素的细胞）所导致的，β细胞被严重损害或完全缺失，导致胰岛素的内源性分泌极低;临床表现为高血糖、高尿糖、糖耐量受损，同时伴随着胰岛素的异常释放，是一种遗传性疾病;因此必须要外源注射胰岛素制剂对机体的血糖水平进行调控。I型糖尿病多发病于儿童或青少年时期，但也有极少数的老年病例。
II型糖尿病，又称为非胰岛素依赖型糖尿病（Noninsulin-Dependent Diabetes Mellitus，NIDDM），相较于I型糖尿病而言，II型糖尿病的发病机理更加复杂，基因与环境因素均能影响II型糖尿病的发生。糖尿病患者中90%以上的人群均属于II型糖尿病，多发病于成年人群，早期症状不明显，病人多肥胖。
II型糖尿病的初始阶段是由于机体的靶细胞对胰岛素产生耐受而引起，从而促使胰岛β细胞产生更多的胰岛素，进而产生胰岛素抵抗效应。在此阶段机体不会表现出高血糖症状，但临床表现为高胰岛素，又称为高胰岛素血症（hyperinsulinemia）。而胰岛β细胞长期处于一种兴奋阶段，导致胰岛β细胞的功能开始衰竭，在此阶段，胰岛β细胞开始凋亡，进而导致胰岛素分泌不足，机体出现高血糖症状从而表现为II型糖尿病。目前普遍认为II型糖尿病是胰岛素相对不足和外周组织对胰岛素不敏感（胰岛素抵抗）所导致的，其真正的致病机理仍有待进一步研究[2]。
2 糖尿病的治疗
胰岛素制剂有动物胰岛素、人胰岛素和胰岛素类似物。根据作用时间分为短效、中效和长效胰岛素，并已制成混合制剂，如诺和灵30R，优泌林70/30。
1型糖尿病需要用胰岛素治疗。非强化治疗者每天注射2～3次，强化治疗者每日注射3～4次，或用胰岛素泵治疗。需经常调整剂量[3]。
2型糖尿病，口服降糖药失效者先采用联合治疗方式，方法为原用口服降糖药剂量不变，睡前晚10∶00注射中效胰岛素或长效胰岛素类似物，一般每隔3天调整1次，目的为空腹血糖降到4.9～8.0毫摩尔/升，无效者停用口服降糖药，改为每天注射2次胰岛素[4]。
胰岛素治疗的最大不良反应为低血糖。
3 常规疗法的弊端
目前无论哪种类型糖尿病，多数人需要每天注射1-4次胰岛素或相关药物。然而每日多次注射药物给糖尿病患者带来了无尽的苦恼[5]！
所以当今社会亟需既缓释的糖尿病药物和无创的给药方法，用以改善全球近4亿糖尿病患者的生活品质！
原理
是否可以设计一种长效的口服糖尿病药物呢？这种药物需要满足两个要求：
（1）要持久，免去糖尿病人每日几针之苦和高昂的费用。需要长效地缓释型或分泌型药物！
（2）用口服剂型改变注射的痛苦。现有的口服药物大多在胃里被分解，吸收差。需要可以顺利通过胃液的剂型！
经过长期的课外思考，一个灵感如穿透密布乌云的一缕阳光般电到了我——通过基因工程手段让肠道益生菌表达降糖活性蛋白！这个创意的核心是：
（1）解决长效的问题：肠道益生菌可在肠道内长期存活并繁衍，由肠道益生菌表达蛋白药物，可以长期持续地分泌药物使肠道吸收进入血液！
（2）解决口服药通过胃液的问题：益生菌的孢子形态能抵抗极端环境，可顺利通过胃液[6]！
（3）基因工程手段可以将编码降糖活性蛋白的基因导入到益生菌中，使其表达蛋白药物。
创新点
（1）借助肠道益生菌载体表达降糖蛋白药物，分泌后经肠道吸收，可实现长效地供药目的。
（2）借助益生菌的孢子形态能抵抗极端环境，可顺利通过胃液，可实现口服给药的目的。 （3）借助基因工程手段将降糖蛋白基因导入益生菌，产生分泌降糖药物的益生菌。
主要内容
该创意分为4部分的设计：益生菌的选择、降血糖药物基因的选择、基因工程方法、益生菌孢子的制备等。
（1）益生菌的选择
本创意选择了地衣芽孢杆菌（如图1），它属于革兰氏阳性细菌。对人来讲可以作为肠道益生菌，可在肠道中长期定殖并排斥有害细菌。它的生活周期为，条件适宜时可以生长和出芽繁殖，条件不适宜时则形成孢子，孢子具有致密的保护层，耐酸碱等极端环境，等待条件适宜的时候萌发，并继续生活周期（如图2）。所以地衣芽孢杆菌的孢子形态可以有效地抵抗胃液的低pH环境，而肠道的环境适宜孢子萌发和成体菌的生存[7]。
图1 地衣芽孢杆菌的形态
图2 地衣芽孢杆菌的生活周期
（2）降血糖药物基因的选择
本创意选择了利拉鲁肽（Liraglutide），长31个氨基酸（序列和结构见图3），是一种GLP-1（胰高血糖素样肽-1）类似物，是一种内源性肠促胰岛素激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素[8，9]。
利拉鲁肽能够以葡萄糖浓度依赖的模式刺激胰岛素的分泌，同时以葡萄糖浓度依赖的模式降低过高的胰高糖素的分泌。因此，当血糖升高时，胰岛素分泌受到刺激，同时胰高糖素分泌受到抑制。与之相反，在低血糖时利拉鲁肽能够减少胰岛素分泌，且不影响胰高糖素的分泌。利拉鲁肽能够通过减轻饥饿感和能量摄入降低体重和体脂量。利拉鲁肽作为一个2型糖尿病的治疗药物，于2010年在美国与欧洲上市[10]。
图3 利拉鲁肽的氨基酸序列（左）和分子结构（右）
4 基因工程方法
本创意将利拉鲁肽的编码基因（含93个碱基的核酸）构建到原核细胞表达质粒上，经过质粒转化导入到地衣芽孢杆菌中，由于该质粒具有原核细胞表达所需的原件，故可在地衣芽孢杆菌中表達并分泌利拉鲁肽。
5 益生菌孢子的制备
细菌形态的地衣芽孢杆菌遇到胃液是很难存活的，一定要先制备成孢子。人工模拟培养环境如温度、湿度、酸碱度、盐离子等条件使转基因的地衣芽孢杆菌形成孢子，将孢子冻干制成药物即为本创意的最终产品。
食用孢子，孢子可以无损地通过胃液，在肠道内萌发、繁殖成转基因益生菌。这种益生菌能表达利拉鲁肽，经肠粘膜上皮细胞吸收入血，刺激胰岛素的分泌，治疗2型糖尿病。
应用价值
全球有近4亿的糖尿病患者，其中大部分是2型。他们需要终身每日注射多支降血糖药物，既承受了巨大的身心痛苦，又需付出极高的经济成本。
本创意旨在开发一种以益生菌为载体的新型长效的口服糖尿病药物，如果实现将从两方面给广大糖尿病患者带来福音：1、多天甚至1个月用一次药物，将患者从繁琐的用药程序里解脱出来;2、用药形式为口服，免去了患者注射药物的痛苦和感染的风险，加大地提高生活品质。
参考文献
[1].中国人群糖尿病疾病负担的系统评价;周海龙，杨晓妍，潘晓平，卢文学，刘祥，周欢;中国循证医学杂志;2014;14 （12）： 1442～1449。
[2].中国2型糖尿病防治指南（2013年版）;中华糖尿病杂志;2014;6 （7）： 447-498。
[3].糖尿病治疗药物的研究进展;贺星，田红，徐颂，李艳凤，陈常青;现代药物与临床;2009;24（3 ）：129-133。
[4].2型糖尿病患者的药物治疗和健康教育;吴荔嘉，林碧英，谢根英;当代医学;2011; 17（22）：43-44。
[5].糖尿病治疗药物——胰岛素研究进展;饶建华，陈廷胜，禹腾波;中国实用医药;2009;4（29）：220-222。
[6].益生菌的分类、生理功能与有效性评价研究进展;李军训，罗学刚，高洁，郝冉，张同存;中国农业科技导报;201 0;12（ 6） ： 49- 55。
[7].饲用地衣芽孢杆菌的生物学特性研究;董尚智，王国霞，陈远凤，程萍;饲料研究;2009;7：14-18.
[8].利拉鲁肽临床研究进展;陈群峰，王永祥;世界临床药物;2013; 34（5）：312-315。
[9].胰岛素及其类似物的研究进展;张春云，蔡永明，张骏，王海荣，张宗鹏;药物评价研究;2010;33（6）：436-441。
[10].利拉鲁肽用于治疗2型糖尿病临床研究现状;陈忻，翟所迪;中国药学杂志;2011;46（21）：1685-1687。