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摘 要：通过分析“肝中酮体的生成作用”实验中学生在小白鼠抓取、处死、组织匀浆液制备、反应液配制等环节中出现的各种问题，提出了一系列改进方法及技巧，规范了操作，提高了实验教学效果。
关键词：小白鼠；酮体；实验改进；实验技巧
中图分类号：G642 文献标志码：A 文章编号：2096-000X（2016）10-0136-02
Abstract： Through the analysis of various problems which occurs in the experiment of "the generation of ketone bodies in liver" when students fetched mice， executed mice， tissued mice serum and reaction liquid preparation， the paper puts forward a series of improvement methods and skills to standardize the operations and improve experimental teaching results.
Keywords： mice； ketone bodies；experimental improvements； experimental skills
生物化学是一门实验性学科，实验对于加深理论知识的理解、巩固记忆，培养分析解决问题能力以及提高创新思维等方面有着极其重要的意义。“肝中酮体的生成作用“是我校专科生在生物化学实验中选做的唯一一项动物实验，学生实验中往往出现各种问题影响着教学效果。作者结合多年教学经验谈几点实验改进技巧，旨在解决学生实验中的存在问题，提高实验成功率，同时，提升学生的综合素质。
一、实验原理
利用丁酸作为底物，与含有酮体生成酶系的肝匀浆混匀、保温后即有酮体生成。酮体中乙酰乙酸和丙酮可与含亚硝酰铁氰化钠的显色粉反应产生紫红色化合物；而经过同样处理的肌肉匀浆，则不产生酮体，因此，与显色粉作用无颜色反应。
二、基本操作步骤
首先，取小白鼠一只，处死，迅速剖腹取出肝脏和肌肉组织，剪碎，分别放入匀浆器中，加入生理盐水（按重量 ： 体积为 1：3），研磨成匀浆（加少许细砂）。然后取试管四支，编号后按表1加入各种试剂。摇匀四支试管，置于37℃恒温水浴中保温40～50分钟后取出，各管再分别加入15%三氯醋酸20滴，摇匀混合，离心3分钟（3000转/分）。最后，分别取出上述各管离心液10滴放于有凹白瓷反应板上，每凹加显色粉1小匙（约0.1g）搅匀，观察所产生的颜色反应[1，2]。
三、理论结果
第一管为紫红色，其他试管为无色。
四、实验中存在的问题及改进技巧
（一）处死实验动物
由于学生初次接触小白鼠，实验中状况百出：如有的逗着玩、不忍心处死、观望、不动手实验；有的不敢碰，小鼠乱跑，学生乱叫，不会抓取；有的将小鼠塞进水里淹死；有的断头处死。在教学中我们首先教育学生要善待小动物，不随便伤害他们。实验用小白鼠要求在不影响实验结果的前提下尽量选择不很痛苦死亡方式。实验前老师先示教：即右手拿镊子迅速从颈背部按压住小鼠后，左手拇指和食指分别捏住小鼠两耳，小指和小鱼际夹住尾巴，翻过来使小鼠腹部朝上。在正确抓取之后，换右手迅速用拇指和食指捏住尾巴，快速轮转，再猛摔头于地上，最后使其颈部脱臼致死。这样摔死方法可以避免学生被小鼠抓伤、咬伤，小鼠死亡时间短、出血也少。同上，节约了实验时间。
（二）组织剪切
本实验要求剪下小鼠的肝脏及两个大腿的肌肉。学生实验中常见小鼠的肝脏被夹碎，出血对多；直接剪下双大腿，拿在手中拨毛皮，再剪肌肉，制备的肌匀浆中混有毛和骨头。针对这种情况，我们首先按手术学要求给学生示教：镊子是拇指对中指与食指，执二镊脚中上部；剪刀持法是用拇指和第四指分别插入剪刀柄两环中，中指在第四指环的剪刀柄上，食指压在轴节处起稳定和向导作用。剪开腹部皮肤及皮下组织，打开腹膜，暴露出肝脏，用镊子轻轻夹住肝脏游离缘，剪刀沿肝脏根部一叶一叶完整剪出肝叶，这样剪取肝脏出血少。取腿部肌肉时，在膝关节处先一手用镊子提起皮肤，剪开膝上部一圈的皮肤，夹住膝部，用剪刀向大腿近端刮拨皮毛就可以暴露出肌肉，一点点地剪下肌肉即可，不必剪断双腿骨头。试验中还可以提示学生是否能采用其它组织（如肾脏等）代替肌肉组织。
（三）匀浆液制备
小鼠肝脏较小，酶活性弱，实验现象可能不明显，可以合并两个实验台的两只小鼠的肝脏，用水冲洗干净表面的血，再制备匀浆液。肌肉匀浆液也同样收集两只小鼠的四条后大腿肌肉制备。
（四）试剂量取与反应液制备
本实验为定性实验，试剂用滴管加，显色粉用药匙加。学生常犯错误是多种试剂共用一个滴管加，取试剂前不清洗，这样使试剂相混；有的学生不摇匀就保温。由于四管的区别主要是肝匀浆和肌匀漿，故要特别强调每加一种试剂一定要清洗滴管，养成每取完一种试剂将本试剂瓶盖盖好，滴管放入盛有蒸馏水的烧杯中，使用前清洗的习惯。实验中也常见学生每人拿一支试管滴加试剂，保温、离心等，这样使得每管反应液从量到质差异较大。为减少人为因素造成的误差。除了每种试剂尽量由同一操作者同时加入，以把握试剂量的均匀一致外，还可以将滴数换算为体积[3]（每ml约15～25滴，平均20滴），用吸量管或微量进样器加入。一勺显色分称量后，取等量显色分加入其它三只试管。
（五）保温
本实验从动物處死、肌肉和肝脏匀浆液制备、滴加试剂、保温、离心到显色，大约需要90分钟，学生往往操作不熟练，不能再有限的课时内完成实验。可以提示学生结合酶学相关知识思考如何能缩短反应时间？学生会联系到温度对酶促反应的影响，即通过提高最适温度来缩短反应时间。这时候再提示学生配置几只试管，分别设置不同温度及时间[4]，观察反应结果，从而得出本实验保温的最短时间是多少。如我们在实验中将原来37℃反应调整为40℃～45℃，使保温时间从原来的40～50分钟缩短为20～30分钟。
（六）显色
加显色粉搅拌时也一样，每搅拌一管，玻璃棒要清洗后， 再搅拌第二只试管的反应液。或者在本项操作中可以从第四管开始，依次三、二、一管顺序分别搅拌，观察颜色。实验结果一般只有第一管显示为淡红色，其它各管均为无色。但试验中也见第二管出现淡红色的，这要提示学生正确分析：一方面因为肝匀浆中存在有少量酮体，可以遇显色粉呈色，但第一管在第二管基础上有新生成的酮体，故第一管颜色较第二管深；另一方面，第二管在没加入底物的条件下是不能生成酮体的，如果肝匀浆中酮体含量少，不会出现颜色的，可能操作有误；再者，颜色的深浅和所加的酮体试剂的量有密切的关系，加的酮体试剂越多，颜色越深，因此要把握酮体粉的量一致。
生化作为医学院校各专业学生必修的一门基础课程，实验所占比例大，不断改进实验教学是提高教学质量的重要途径。本实验通过对细节问题的分析与改进，一方面，让学生规范操作，减少干扰因素，提高实验的成功率，培养其创新思维及分析、解决问题的能力。另一方面，用科学、正确的态度和严谨的作风对待动物实验，正确认识小鼠，学会正确拿取，为后续学科中小鼠实验和外科手术中器械的正确使用奠定基础。
参考文献
[1]黄平.生物化学[M].北京：人民卫生出版社，2003：245-246.
[2]张申，庄景凡.医学生物化学实验指导与学习指南[M].北京：北京大学医学出版社，2011：32-33.
[3]何旭辉.生物化学（第2版）[M].北京：人民卫生出版社，2010：220-222.
[4]龙跃娥.酮体生成的实验改进[J].卫生职业教育，2009，27（11）：159.
关键词：小白鼠；酮体；实验改进；实验技巧
中图分类号：G642 文献标志码：A 文章编号：2096-000X（2016）10-0136-02
Abstract： Through the analysis of various problems which occurs in the experiment of "the generation of ketone bodies in liver" when students fetched mice， executed mice， tissued mice serum and reaction liquid preparation， the paper puts forward a series of improvement methods and skills to standardize the operations and improve experimental teaching results.
Keywords： mice； ketone bodies；experimental improvements； experimental skills
生物化学是一门实验性学科，实验对于加深理论知识的理解、巩固记忆，培养分析解决问题能力以及提高创新思维等方面有着极其重要的意义。“肝中酮体的生成作用“是我校专科生在生物化学实验中选做的唯一一项动物实验，学生实验中往往出现各种问题影响着教学效果。作者结合多年教学经验谈几点实验改进技巧，旨在解决学生实验中的存在问题，提高实验成功率，同时，提升学生的综合素质。
一、实验原理
利用丁酸作为底物，与含有酮体生成酶系的肝匀浆混匀、保温后即有酮体生成。酮体中乙酰乙酸和丙酮可与含亚硝酰铁氰化钠的显色粉反应产生紫红色化合物；而经过同样处理的肌肉匀浆，则不产生酮体，因此，与显色粉作用无颜色反应。
二、基本操作步骤
首先，取小白鼠一只，处死，迅速剖腹取出肝脏和肌肉组织，剪碎，分别放入匀浆器中，加入生理盐水（按重量 ： 体积为 1：3），研磨成匀浆（加少许细砂）。然后取试管四支，编号后按表1加入各种试剂。摇匀四支试管，置于37℃恒温水浴中保温40～50分钟后取出，各管再分别加入15%三氯醋酸20滴，摇匀混合，离心3分钟（3000转/分）。最后，分别取出上述各管离心液10滴放于有凹白瓷反应板上，每凹加显色粉1小匙（约0.1g）搅匀，观察所产生的颜色反应[1，2]。
三、理论结果
第一管为紫红色，其他试管为无色。
四、实验中存在的问题及改进技巧
（一）处死实验动物
由于学生初次接触小白鼠，实验中状况百出：如有的逗着玩、不忍心处死、观望、不动手实验；有的不敢碰，小鼠乱跑，学生乱叫，不会抓取；有的将小鼠塞进水里淹死；有的断头处死。在教学中我们首先教育学生要善待小动物，不随便伤害他们。实验用小白鼠要求在不影响实验结果的前提下尽量选择不很痛苦死亡方式。实验前老师先示教：即右手拿镊子迅速从颈背部按压住小鼠后，左手拇指和食指分别捏住小鼠两耳，小指和小鱼际夹住尾巴，翻过来使小鼠腹部朝上。在正确抓取之后，换右手迅速用拇指和食指捏住尾巴，快速轮转，再猛摔头于地上，最后使其颈部脱臼致死。这样摔死方法可以避免学生被小鼠抓伤、咬伤，小鼠死亡时间短、出血也少。同上，节约了实验时间。
（二）组织剪切
本实验要求剪下小鼠的肝脏及两个大腿的肌肉。学生实验中常见小鼠的肝脏被夹碎，出血对多；直接剪下双大腿，拿在手中拨毛皮，再剪肌肉，制备的肌匀浆中混有毛和骨头。针对这种情况，我们首先按手术学要求给学生示教：镊子是拇指对中指与食指，执二镊脚中上部；剪刀持法是用拇指和第四指分别插入剪刀柄两环中，中指在第四指环的剪刀柄上，食指压在轴节处起稳定和向导作用。剪开腹部皮肤及皮下组织，打开腹膜，暴露出肝脏，用镊子轻轻夹住肝脏游离缘，剪刀沿肝脏根部一叶一叶完整剪出肝叶，这样剪取肝脏出血少。取腿部肌肉时，在膝关节处先一手用镊子提起皮肤，剪开膝上部一圈的皮肤，夹住膝部，用剪刀向大腿近端刮拨皮毛就可以暴露出肌肉，一点点地剪下肌肉即可，不必剪断双腿骨头。试验中还可以提示学生是否能采用其它组织（如肾脏等）代替肌肉组织。
（三）匀浆液制备
小鼠肝脏较小，酶活性弱，实验现象可能不明显，可以合并两个实验台的两只小鼠的肝脏，用水冲洗干净表面的血，再制备匀浆液。肌肉匀浆液也同样收集两只小鼠的四条后大腿肌肉制备。
（四）试剂量取与反应液制备
本实验为定性实验，试剂用滴管加，显色粉用药匙加。学生常犯错误是多种试剂共用一个滴管加，取试剂前不清洗，这样使试剂相混；有的学生不摇匀就保温。由于四管的区别主要是肝匀浆和肌匀漿，故要特别强调每加一种试剂一定要清洗滴管，养成每取完一种试剂将本试剂瓶盖盖好，滴管放入盛有蒸馏水的烧杯中，使用前清洗的习惯。实验中也常见学生每人拿一支试管滴加试剂，保温、离心等，这样使得每管反应液从量到质差异较大。为减少人为因素造成的误差。除了每种试剂尽量由同一操作者同时加入，以把握试剂量的均匀一致外，还可以将滴数换算为体积[3]（每ml约15～25滴，平均20滴），用吸量管或微量进样器加入。一勺显色分称量后，取等量显色分加入其它三只试管。
（五）保温
本实验从动物處死、肌肉和肝脏匀浆液制备、滴加试剂、保温、离心到显色，大约需要90分钟，学生往往操作不熟练，不能再有限的课时内完成实验。可以提示学生结合酶学相关知识思考如何能缩短反应时间？学生会联系到温度对酶促反应的影响，即通过提高最适温度来缩短反应时间。这时候再提示学生配置几只试管，分别设置不同温度及时间[4]，观察反应结果，从而得出本实验保温的最短时间是多少。如我们在实验中将原来37℃反应调整为40℃～45℃，使保温时间从原来的40～50分钟缩短为20～30分钟。
（六）显色
加显色粉搅拌时也一样，每搅拌一管，玻璃棒要清洗后， 再搅拌第二只试管的反应液。或者在本项操作中可以从第四管开始，依次三、二、一管顺序分别搅拌，观察颜色。实验结果一般只有第一管显示为淡红色，其它各管均为无色。但试验中也见第二管出现淡红色的，这要提示学生正确分析：一方面因为肝匀浆中存在有少量酮体，可以遇显色粉呈色，但第一管在第二管基础上有新生成的酮体，故第一管颜色较第二管深；另一方面，第二管在没加入底物的条件下是不能生成酮体的，如果肝匀浆中酮体含量少，不会出现颜色的，可能操作有误；再者，颜色的深浅和所加的酮体试剂的量有密切的关系，加的酮体试剂越多，颜色越深，因此要把握酮体粉的量一致。
生化作为医学院校各专业学生必修的一门基础课程，实验所占比例大，不断改进实验教学是提高教学质量的重要途径。本实验通过对细节问题的分析与改进，一方面，让学生规范操作，减少干扰因素，提高实验的成功率，培养其创新思维及分析、解决问题的能力。另一方面，用科学、正确的态度和严谨的作风对待动物实验，正确认识小鼠，学会正确拿取，为后续学科中小鼠实验和外科手术中器械的正确使用奠定基础。
参考文献
[1]黄平.生物化学[M].北京：人民卫生出版社，2003：245-246.
[2]张申，庄景凡.医学生物化学实验指导与学习指南[M].北京：北京大学医学出版社，2011：32-33.
[3]何旭辉.生物化学（第2版）[M].北京：人民卫生出版社，2010：220-222.
[4]龙跃娥.酮体生成的实验改进[J].卫生职业教育，2009，27（11）：159.