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摘要：【目的】優化具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）T-1株的培养基及发酵条件，进一步提高其产孢量，为今后开发地衣芽孢杆菌制剂（抗菌益生菌）打下基础。【方法】在摇床发酵条件下，采用单因素试验筛选T-1株的最佳培养条件，并确定影响发酵菌液活菌含量的主要影响因素。根据Plackett-Burman试验结果，筛选出影响芽孢产量的2个最显著因素，以最陡爬坡试验确定其响应中心点和最佳浓度范围，然后通过Box-Behnken中心组合试验和响应面分析获得最佳发酵培养条件。【结果】T-1株的最适发酵培养条件为温度37 ℃、盐度0.5%和pH 6.0，在此条件下T-1株芽孢产量与培养时间呈正相关，在培养48～60 h期间其芽孢产量趋于稳定。在对T-1株芽孢产量影响较大的6个因子[X1（糖蜜）、X2（可溶性淀粉）、X3（酵母浸粉）、X4（CaCl2）、X5（摇床转速）和X6（接种量）]中，X2（可溶性淀粉）对T-1株芽孢产量的影响达显著水平（P<0.05），X5（摇床转速）的影响达极显著水平（P<0.01），其他因子的影响均不显著（P>0.05）。T-1株的最佳培养基为可溶性淀粉1.11%、酵母浸粉0.3%和CaCl2 0.5%，在摇床转速218 r/min的培养条件下，其芽孢产量较优化前采用初始基础培养基的芽孢产量提高6.25倍。【结论】具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株在优化后的发酵培养条件下，其芽孢产量较优化前明显提高，且延长菌株生长的稳定期，加上优化筛选出的培养基是采用相对廉价且高效的原材料，有效节约了生产发酵成本，可在规模化生产上推广应用。
关键词： 地衣芽孢杆菌;培养基;发酵条件;单因素试验;响应面分析法
中图分类号： S917.1 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）11-2559-08
Optimization of culture media and fermentation conditions of quorum sensing quenching bacteria Bacillus licheniformis T-1
TONG Wen-tao1，2， CHEN Biao1，2， PENG Meng-fan1，2， ZHAO Zhen1，2，
XIAO Ling1，2， SONG Zeng-fu1，2*， ZHANG Qing-hua1，3*
（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China; 2National Pathogen Collection for Aquatic Animals， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China; 3Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources， Ministry of Education，
Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）
Abstract：【Objective】To optimize the culture medium and fermentation conditions of Bacillus licheniformis T-1 strain with quorum induction quenching effect， further increase its spore production，lay the foundation for future development of Bacillus licheniformis preparations（antibacterial probiotics）. 【Method】The optimum culture condition of T-1 bacterial strain was screened and chosen in the way of single factor method under the shaking flask fermentation condition， and the main influencing factors affecting the live bacteria content of the fermentation broth were determined. According to the results of Plackett-Burman test， the two most significant factors affecting spore yield were screened. The steepest climbing test was used to determine the response center point and the optimal concentration range of the two factors， and then the box-Behnken center combination test and response surface were used to obtain the best fermentation culture conditions. 【Result】The optimal culture temperature was 37 ℃， the optimum growth salinity was 0.5% and the optimum growth pH was 6. Under this condition， the spore formation was in positive correlation with culture time. The sporulation rate were stable between 48-60 h. Among the six factors that had great impact on the spore yield of T-1 strains[X1（molasses）， X2（soluble starch）， X3（yeast extract powder）， X4（CaCl2）， X5（shaker speed）， and X6（inoculation amount）]，the effect of X2（soluble starch） on the spore yield of T-1 strain reached a significant level（P<0.05）， the effect of X5（shaker speed） reached an extremely significant level（P<0.01）， and the effects of other factors were not significant（P>0.05）. The optimal medium for T-1 strain was 1.11% soluble starch， 0.3% yeast extract powder and 0.5% CaCl2. Under the culture conditions of 218 r/min shaker speed， the spore yield of the T-1 strain was higher than that of the original basic medium before optimization. The spore yield increased by 6.25 times. 【Conclusion】Under the optimized fermentation conditions， B. licheniformis T-1 strain with quorum induction quenching can increase its spore yield greatly compared with the original method. Its stable period of growth also prolongs. Since the optimized media use cheap but high efficient raw materials， the fermentation costs can be reduced. This method can be applied in large-scale production in the future. Key words： Bacillus licheniformis; media; fermentation conditions; single factor methodology; response surface methodology
0 引言
【研究意义】细菌的群体感应是其自体诱导现象，细菌通过感知群体感应信号分子，调控毒力因子表达及生物膜形成等生理现象（许玉彬等，2013）。群体感应淬灭可通过降解群体感应信号分子或抑制其合成而阻断病原菌毒力基因的表达，在不杀死病原菌的基础上有效降低其致病性（王岩等，2017）。目前，群体感应淬灭酶包括群体感应信号分子的内酯酶、酰基水解酶及氧化酶还原酶3种，其中酰基高丝氨酸内酯酶是发现最早和研究最深入的群体感应淬灭酶。群体感应淬灭酶最早在芽孢杆菌240B1（Bacillus sp. 240B1）中发现（Dong et al.，2000），随后陆续在不同菌属中发现多种淬灭酶基因，包括attM、ahlD、ytnP、ahlS和aidH等基因（Zhang et al.，2002;Park et al.，2003;Mei et al.，2010;Morohoshi et al.，2012;Schneider et al.，2012）。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）T-1株是国家水生动物病原库从水产动物肠道分离筛选获得，具有良好的群体感应淬灭效果，尤其对感染嗜水气单胞菌的斑马鱼具有良好抗感染能力，具备开发成抗菌益生菌的潜力（宋增福等，2015;Chen et al.，2019）。因此，优化地衣芽孢杆菌T-1株的培养基及发酵条件，可为更好地利用该菌进行后续发酵生产提供技术指导。【前人研究进展】目前，关于芽孢杆菌培养基优化的研究已有较多报道，且主要采用常规的正交试验设计进行优化。洪剑辉（2015）通过正交试验设计对棘孢小单孢菌产庆大霉素B发酵培养基进行优化，优化后其产庆大霉素B量较原配方提高20%;刘宽博等（2016）使用正交试验设计优化枯草芽孢杆菌C3的培养基组成，优化后枯草芽孢杆菌C3的活菌数达7.1×1010 CFU/mL，细菌浓度提高7.89倍;邵帅（2016）以正交试验设计优化夏孢生枝孢菌株的发酵条件及培养基组分，优化后的菌株发酵上清液对黄曲霉毒素B1的降解率提高1.40倍;Wang等（2017）采用正交试验设计对食用真菌的发酵培养基进行优化，优化后其发酵液中的黄酮类和可溶性蛋白分别为1.551和0.691 mg/mL;王忠忠和龚国利（2017）以正交试验设计优化短小芽孢杆菌株M01抗菌活性物质的发酵工艺，优化后其抑菌活性提高38.7%;叶碧霞等（2017）采用正交试验设计对枯草芽孢杆菌的培养基及培养条件进行优化，优化后的枯草芽孢杆菌数达1.03×1010 CFU/mL;陈海超等（2018）通过正交试验设计优化汉逊氏葡糖酸醋杆菌培养条件，优化后细胞膜干重的产量提高3倍;Liu等（2018）采用正交试验设计对巨大芽孢杆菌的发酵培养基进行优化，优化后的发酵液用于作物肥料，能使农作物产量提高25.91%;王海德（2018）通过正交试验设计优化空气芽孢杆菌的培养基组成，使其活菌数高达7.65×109 CFU/mL，細菌浓度提高117倍;张同睿（2018）以正交试验设计对多粘类芽孢杆菌SC2抗细菌活性物质的发酵条件及其培养基配方进行优化，优化后抗菌物质的最终产量约提高4倍。【本研究切入点】由于正交试验设计不能给出明确的函数表达式以确定整个区域的最佳因素组合及最佳响应值，难以获得理想的优化效果（李姝江等，2019）;且单因素试验是通过逐个考察各因素以修正其他因素，但各因素间存在交互作用，因此获得的最佳条件并非最优条件。响应面分析是一种回归分析方法，所求得的回归方程精度高，能研究多种因素间的交互作用，且周期短和试验次数少;同时可建立数学模型，通过多元二次回归方程来解决最优组合受多个变量影响的问题（徐敏强，2018）。因此，利用响应面分析法进行微生物培养基优化可获得良好的效果，但至今未见以响应面分析法优化地衣芽孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的研究报道。【拟解决的关键问题】采用单因素试验和响应面分析法对具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株的培养基和发酵条件进行优化，进一步提高其产孢量，为后续开发地衣芽孢杆菌制剂（抗菌益生菌）打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
地衣芽孢杆菌T-1株由国家水生动物病原库筛选获得，保藏于中国微生物保藏中心，保藏编号CCTCC M2014049。LB培养基（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2）和LB液体培养基（蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4）自制，碳源（糖蜜、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麸皮粉和蛋白胨）、氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉、黄豆粉、KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）、无机盐（NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2）均为国产分析纯。主要仪器设备：超净工作台（SJ-CJ-1FD）、恒温培养箱（LHP-100）、高速冷冻离心机（KT7-900-430）、振荡培养箱（INNOVA 40R）、紫外分光光度计（UPG-722）和光照培养箱（MGC-350BP）。
1. 2 T-1株最佳培养条件的单因素试验
1. 2. 1 最佳培养温度 参考陈海超等（2018）的方法，将过夜培养菌液按1%比例接种到5 mL营养肉汤试管中（pH 7.0），分别置于20、24、28、32、37、42、46和50 ℃的摇床上振荡培养18 h后测OD600，确定T-1株生长的最佳温度。每个温度组设3个平行。
1. 2. 2 最佳pH 参考叶碧霞等（2017）的方法，用1 mol/L HCl或NaOH将培养基pH调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，将过夜培养菌液按1%比例接种到5 mL营养肉汤试管中，置于37 ℃摇床上振荡培养18 h后测OD600，确定T-1株生长的最佳pH。每个pH设3个平行。 1. 2. 3 最佳盐度 参照胡桂萍等（2018）的方法，将过夜培养菌液按1%比例接种到5 mL营养肉汤试管中（pH 7.0），按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%和8.0%的梯度盐度进行摇床振荡培养18 h后测OD600，确定T-1株生长的最佳盐度。每个盐度设3个平行。
1. 3 T-1株菌液OD600与活菌数量的关系
参考Ushakiranmayi等（2017）的方法，梯度稀释待测菌液10-3～10-7，取稀释菌液200 ?L均匀涂布于营养琼脂培养基上，每个梯度重复3次，培养24 h后统计活菌数。
1. 4 T-1株生长曲线绘制
参考叶碧霞等（2017）的方法，将T-1株的菌液按1%比例接种到营养肉汤培养基中，37 ℃下摇床培养。每4 h测量一次菌液OD600，以未接种菌液的培养基为空白对照，绘制T-1株培养时间与OD600的生长曲线。
1. 5 T-1株活菌数、芽孢数与时间的关系
活菌数测定参考叶碧霞等（2017）的方法，将T-1株菌液按1%比例接种到营养肉汤培养基中，37 ℃下摇床培养，采用稀释涂布法分别对培养4、8、12、16、20、24、36、48、60和72 h后的菌液进行活菌计数，每个梯度重复3次，测出各时段的活菌数。芽孢数测定参考Roy等（2013）的方法，将待测菌液置于80 ℃水浴锅中水浴15 min，然后按活菌计数方法进行计数，每个梯度重复3次，测量各时段的芽孢产量。
1. 6 发酵培养基组分单因素试验
1. 6. 1 最佳碳源筛选 分别选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、可溶性淀粉、麸皮粉和蛋白胨作为唯一碳源（1.0%），以牛肉浸粉为氮源（0.3%），装液量150 mL，接种量3%，37 ℃下摇床（150 r/min）培养54 h。按照碳源不同设8个试验组，每组3个平行，测量菌液OD600及其芽孢产量。
1. 6. 2 最佳氮源筛选 以最佳碳源为碳源（1.0%），选取5种有机氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉和黄豆粉）和4种无机氮源（KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）作为氮源（0.3%），装液量150 mL，接种量3%，37 ℃下摇床（150 r/min）培养54 h。按照碳源不同设9个试验组，每组3个平行，测量菌液OD600及其芽孢产量。
1. 6. 3 最佳无机盐筛选 在最佳碳源和氮源的基础上，选取NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2等7种无机盐（0.5%），装液量150 mL，接种量3%，37 ℃下摇床（150 r/min）培养54 h。按照无机盐不同设7个试验组，每组3个平行，测量菌液OD600及其芽孢产量。
1. 7 响应面分析法优化培养基成分及配比
1. 7. 1 Plackett-Burman试验设计 根据单因素试验结果，确定6个对芽孢产量影响较大的因子。采用Minitab 16.0中的Plackett-Burman试验设计筛选发酵培养基中影响芽孢产量的主要因子，依次设为X1（糖蜜）、X2（可溶性淀粉）、X3（酵母浸粉）、X4（CaCl2）、X5（搖床转速）和X6（接种量），每个因素取高低两个水平（El-Gherab et al.，2018）。
1. 7. 2 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman试验设计得出的一次拟合方程确定因素取值中心点，并确定主要因素的爬坡方向和变化步长;然后根据最陡爬坡试验中菌液芽孢产量的变化趋势，确定Box-Behnken试验设计的中心点及最适质量浓度范围（El-Gherab et al.，2018）。
1. 7. 3 响应面分析 根据最陡爬坡试验结果，确定Plackett-Burman试验设计中主要因素的最适质量浓度范围。采用Minitab 16.0中的Box-Behnken设计3因素优化试验，通过响应面分析各因素间的相互作用。
1. 8 统计分析
采用Excel 2010进行试验数据整理，利用Mini-tab 16.0对单因素试验结果和响应面分析结果进行方差分析，并通过最小显著性差异（LSD）进行多重比较。
2 结果与分析
2. 1 T-1株最佳发酵培养条件的单因素试验结果
由图1-A可看出，菌液OD600随培养温度的升高呈先升高后降低的变化趋势，于37 ℃时达最高值（0.425），即T-1株的最佳生长温度为37 ℃。由图1-B可看出，当pH由3.0逐渐上升至6.0时，菌液OD600随之升高，但pH继续上升后菌液OD600开始降低，说明T-1株适合在偏酸性环境下生长，最佳pH为6.0。由图1-C可看出，当培养基盐度为0.5%时，菌液OD600达最高值（0.453），但盐度继续增加时菌液OD600开始降低。由图1-D可看出，当菌液OD600大于0.859后菌液OD600与活菌数量间的关系趋于直线变化，当菌液OD600为1.604时，活菌数量达5.0×109 CFU/mL。
2. 2 T-1株活菌数和芽孢产量与培养时间的关系
由T-1株在37 ℃下摇床（150 r/min）培养的生长曲线（图2-A）可看出，0～4 h为菌株生长的迟缓期，4～24 h为对数增长期，24～48 h菌株生长达稳定期，48 h后为衰亡期。由图2-B可看出，T-1株的芽孢产量随摇床培养时间的延长逐步增加，即与培养时间呈正相关;培养至48 h后其活菌数呈下降趋势，而芽孢产量依然呈增加趋势。T-1株的活菌数在培养48～60 h期间其芽孢产量趋于稳定。
2. 3 T-1株最佳发酵培养基组分的单因素试验结果
2. 3. 1 最佳碳源筛选 以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、可溶性淀粉、麸皮粉和蛋白胨等8种碳源进行单因素试验，结果（表1）显示，可溶性淀粉组和葡萄糖组的菌液OD600较高，分别为1.308和1.200，而糖蜜组和可溶性淀粉组的芽孢产量较高，分别为1.28×108和1.66×108 CFU/mL。综合生产成本及培养效果，选取可溶性淀粉和糖蜜进行响应面分析。 2. 3. 2 最佳氮源筛选 选用5种有机氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉和黄豆粉）和4种无机氮源（KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）进行单因素试验，结果（表2）显示，酵母浸粉组的菌液OD600和芽孢产量均最高，分别为1.853和4.30×108 CFU/mL，因此选择酵母浸粉为最佳氮源。
2. 3. 3 最佳无机盐筛选 以可溶性淀粉为碳源、酵母浸粉为氮源，选择NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2等7种无机盐进行单因素试验，结果（表3）显示，CaCl2组的菌液OD600和芽孢产量均最高，分别为1.930和6.35×108 CFU/mL，因此选择CaCl2为最佳无机盐。
2. 4 响应面分析结果
2. 4. 1 Plackett-Burman试验结果 Plackett-Burman试验设计采用n=12，对6个因素（X1、X2、X3、X4、X5和X6）进行分析，并利用Minitab 16.0对试验结果（表4）进行统计分析，结果（表5）表明，X2（可溶性淀粉）对T-1株芽孢产量的影响达显著水平（P<0.05，下同），而X5（摇床转速）对芽孢产量的影响达极显著水平（P<0.01）。
2. 4. 2 最陡爬坡试验结果 由表5可知，X2（可溶性淀粉）对T-1株芽孢产量具有显著负效应，因此最陡爬坡试验应沿着可溶性淀粉浓度减少的方向进行设计;而X5（摇床转速）对T-1株芽孢产量具有极显著正效应，因此最陡爬坡试验应沿着转速升高的方向进行设计。最陡爬坡试验结果（表6）表明，在可溶性淀粉1.2%和摇床转速220 r/min附近区域时，T-1株的芽孢产量达最高值（27.7×108 CFU/mL）。
2. 4. 3 Box-Behnken中心组合试验结果 根据最陡爬坡试验结果（表6）设计Box-Behnken中心组合试验，其中可溶性淀粉和摇床转速的中心点分别为X1=1.2%和X2=220 r/min，具体因素水平设计见表7。对Box-Behnken中心组合试验结果（表8）进行方差分析，可知回归模型的决定系数为93.54%，P=0.000，失拟项P为0.764，表明拟合得到的回归模型显著且无失拟现象。由表9可知，回归模型的线性和平方对菌株芽孢产量的影响达显著水平，而交互作用对菌株芽孢产量的影响不显著;拟合得到的二次回归方程为Y芽孢产量=10.52+0.51X1-329.20X2-1.05X12-1.05X22+0.075X1X2。
利用响应优化器对拟合的二次回归方程进行求值（图4），得知当X1=1.11%、X2=218.43 r/min时，Y芽孢产量达最大值（10.59）。为进一步验证响应面分析结果，进行3次重复试验，结果显示T-1株芽孢产量的平均值为（10.52±4.50）×108 CFU/mL，与理论预测值相近，说明该回归模型预测结果可靠。与优化前采用初始基础培养基的T-1株芽孢产量（2.15×108 CFU/mL）相比，優化后的T-1株芽孢产量提高6.25倍。
3 讨论
抗生素是目前水产养殖行业常用的化学防治药物，但抗生素易使菌株产生耐药性，毒副作用强且存在环境污染等缺点，欧盟已于2006年全面停止使用抗生素作为饲料添加剂应用于水产养殖行业（倪军等，2018），即目前迫切需要一种新型安全绿色无污染的抗菌制剂来替代抗生素应用于水产养殖行业，尤其在生态环境和食品安全越来越受到重视的背景下，加快新型抗菌制剂的研制对促进水产养殖业健康发展具有重要意义。在本课题组前期的研究基础上，本研究采用单因素试验和响应面分析法对地衣芽孢杆菌T-1株的发酵培养条件进行优化，结果表明，以酵母浸粉为唯一氮源，T-1株的芽孢产量最高（4.30×108 CFU/mL），是由于酵母浸粉富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素和微量元素，与朱天辉等（2013）的研究结果一致;以CaCl2为唯一无机盐时，T-1株的芽孢产量明显高于其他无机盐，是由于Ca2+在细胞中控制其体内的渗透压，且Ca2+是某些生物酶的激活剂，能保障细胞正常的机体功能和酶活特性，与林陈强等（2011）的研究结果一致。
本研究基于单因素试验和Plackett-Burman试验，筛选出对T-1株芽孢产量影响显著的2个因素分别是可溶性淀粉和摇床转速，并通过最陡爬坡试验找出这2个因素的中心点，然后利用响应面分析法中的Box-Behnken中心组合试验设计筛选出最佳发酵培养条件。结合T-1株的生物学特性及其培养基优化条件，发现在温度37 ℃、pH 6.0、可溶性淀粉1.11%、酵母浸粉0.3%、CaCl2 0.5%、摇床转速218 r/min的条件下培养54 h，其芽孢产量为10.59×109 CFU/mL，较优化前初始基础培养基的菌株芽孢产量提高6.25倍。优化后的培养基能有效提高地衣芽孢杆菌T-1株发酵产孢数量，保证微生态制剂的含菌量;此外，优化筛选出的培养基是采用相对廉价且高效的原材料，有效节约了生产发酵成本，可在规模化生产上推广应用。
李冠杰等（2018）研究表明，地衣芽孢杆菌YDY株的最适发酵条件为培养温度 37 ℃、pH 8.0、接种量体积分数1%。王珊珊等（2018）研究发现，地衣芽孢杆菌LS-1株的最适培养条件为培养温度40 ℃、初始pH 12.0、接种量体积分数4%。在本研究的发酵培养条件下，地衣芽孢杆菌T-1株的生长对数期为4～24 h，即收集菌体的最佳时间为18～24 h，48 h后开始进入衰亡期，与刘莹等（2006）研究发现T-1株从培养21 h后进入衰亡期的结论相比，极大延长了地衣芽孢杆菌生长的稳定期。T-1株在温度37 ℃、摇床转速218 r/min的条件下培养48 h，其芽孢产量可达最大值，与解顺昌等（2015）的研究结果基本一致。可见，不同菌株的最佳发酵培养条件也不同，且差距较大，但具体原因有待进一步研究验证。 4 结论
具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株在优化后的发酵培养条件下，其芽孢产量较优化前明显提高6.25倍，且延长菌株生长的稳定期，加上优化筛选出的培养基是采用相对廉价且高效的原材料，有效节约了生产发酵成本，可在规模化生产上推广应用。
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（責任编辑 兰宗宝）
关键词： 地衣芽孢杆菌;培养基;发酵条件;单因素试验;响应面分析法
中图分类号： S917.1 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）11-2559-08
Optimization of culture media and fermentation conditions of quorum sensing quenching bacteria Bacillus licheniformis T-1
TONG Wen-tao1，2， CHEN Biao1，2， PENG Meng-fan1，2， ZHAO Zhen1，2，
XIAO Ling1，2， SONG Zeng-fu1，2*， ZHANG Qing-hua1，3*
（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China; 2National Pathogen Collection for Aquatic Animals， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China; 3Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources， Ministry of Education，
Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）
Abstract：【Objective】To optimize the culture medium and fermentation conditions of Bacillus licheniformis T-1 strain with quorum induction quenching effect， further increase its spore production，lay the foundation for future development of Bacillus licheniformis preparations（antibacterial probiotics）. 【Method】The optimum culture condition of T-1 bacterial strain was screened and chosen in the way of single factor method under the shaking flask fermentation condition， and the main influencing factors affecting the live bacteria content of the fermentation broth were determined. According to the results of Plackett-Burman test， the two most significant factors affecting spore yield were screened. The steepest climbing test was used to determine the response center point and the optimal concentration range of the two factors， and then the box-Behnken center combination test and response surface were used to obtain the best fermentation culture conditions. 【Result】The optimal culture temperature was 37 ℃， the optimum growth salinity was 0.5% and the optimum growth pH was 6. Under this condition， the spore formation was in positive correlation with culture time. The sporulation rate were stable between 48-60 h. Among the six factors that had great impact on the spore yield of T-1 strains[X1（molasses）， X2（soluble starch）， X3（yeast extract powder）， X4（CaCl2）， X5（shaker speed）， and X6（inoculation amount）]，the effect of X2（soluble starch） on the spore yield of T-1 strain reached a significant level（P<0.05）， the effect of X5（shaker speed） reached an extremely significant level（P<0.01）， and the effects of other factors were not significant（P>0.05）. The optimal medium for T-1 strain was 1.11% soluble starch， 0.3% yeast extract powder and 0.5% CaCl2. Under the culture conditions of 218 r/min shaker speed， the spore yield of the T-1 strain was higher than that of the original basic medium before optimization. The spore yield increased by 6.25 times. 【Conclusion】Under the optimized fermentation conditions， B. licheniformis T-1 strain with quorum induction quenching can increase its spore yield greatly compared with the original method. Its stable period of growth also prolongs. Since the optimized media use cheap but high efficient raw materials， the fermentation costs can be reduced. This method can be applied in large-scale production in the future. Key words： Bacillus licheniformis; media; fermentation conditions; single factor methodology; response surface methodology
0 引言
【研究意义】细菌的群体感应是其自体诱导现象，细菌通过感知群体感应信号分子，调控毒力因子表达及生物膜形成等生理现象（许玉彬等，2013）。群体感应淬灭可通过降解群体感应信号分子或抑制其合成而阻断病原菌毒力基因的表达，在不杀死病原菌的基础上有效降低其致病性（王岩等，2017）。目前，群体感应淬灭酶包括群体感应信号分子的内酯酶、酰基水解酶及氧化酶还原酶3种，其中酰基高丝氨酸内酯酶是发现最早和研究最深入的群体感应淬灭酶。群体感应淬灭酶最早在芽孢杆菌240B1（Bacillus sp. 240B1）中发现（Dong et al.，2000），随后陆续在不同菌属中发现多种淬灭酶基因，包括attM、ahlD、ytnP、ahlS和aidH等基因（Zhang et al.，2002;Park et al.，2003;Mei et al.，2010;Morohoshi et al.，2012;Schneider et al.，2012）。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）T-1株是国家水生动物病原库从水产动物肠道分离筛选获得，具有良好的群体感应淬灭效果，尤其对感染嗜水气单胞菌的斑马鱼具有良好抗感染能力，具备开发成抗菌益生菌的潜力（宋增福等，2015;Chen et al.，2019）。因此，优化地衣芽孢杆菌T-1株的培养基及发酵条件，可为更好地利用该菌进行后续发酵生产提供技术指导。【前人研究进展】目前，关于芽孢杆菌培养基优化的研究已有较多报道，且主要采用常规的正交试验设计进行优化。洪剑辉（2015）通过正交试验设计对棘孢小单孢菌产庆大霉素B发酵培养基进行优化，优化后其产庆大霉素B量较原配方提高20%;刘宽博等（2016）使用正交试验设计优化枯草芽孢杆菌C3的培养基组成，优化后枯草芽孢杆菌C3的活菌数达7.1×1010 CFU/mL，细菌浓度提高7.89倍;邵帅（2016）以正交试验设计优化夏孢生枝孢菌株的发酵条件及培养基组分，优化后的菌株发酵上清液对黄曲霉毒素B1的降解率提高1.40倍;Wang等（2017）采用正交试验设计对食用真菌的发酵培养基进行优化，优化后其发酵液中的黄酮类和可溶性蛋白分别为1.551和0.691 mg/mL;王忠忠和龚国利（2017）以正交试验设计优化短小芽孢杆菌株M01抗菌活性物质的发酵工艺，优化后其抑菌活性提高38.7%;叶碧霞等（2017）采用正交试验设计对枯草芽孢杆菌的培养基及培养条件进行优化，优化后的枯草芽孢杆菌数达1.03×1010 CFU/mL;陈海超等（2018）通过正交试验设计优化汉逊氏葡糖酸醋杆菌培养条件，优化后细胞膜干重的产量提高3倍;Liu等（2018）采用正交试验设计对巨大芽孢杆菌的发酵培养基进行优化，优化后的发酵液用于作物肥料，能使农作物产量提高25.91%;王海德（2018）通过正交试验设计优化空气芽孢杆菌的培养基组成，使其活菌数高达7.65×109 CFU/mL，細菌浓度提高117倍;张同睿（2018）以正交试验设计对多粘类芽孢杆菌SC2抗细菌活性物质的发酵条件及其培养基配方进行优化，优化后抗菌物质的最终产量约提高4倍。【本研究切入点】由于正交试验设计不能给出明确的函数表达式以确定整个区域的最佳因素组合及最佳响应值，难以获得理想的优化效果（李姝江等，2019）;且单因素试验是通过逐个考察各因素以修正其他因素，但各因素间存在交互作用，因此获得的最佳条件并非最优条件。响应面分析是一种回归分析方法，所求得的回归方程精度高，能研究多种因素间的交互作用，且周期短和试验次数少;同时可建立数学模型，通过多元二次回归方程来解决最优组合受多个变量影响的问题（徐敏强，2018）。因此，利用响应面分析法进行微生物培养基优化可获得良好的效果，但至今未见以响应面分析法优化地衣芽孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的研究报道。【拟解决的关键问题】采用单因素试验和响应面分析法对具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株的培养基和发酵条件进行优化，进一步提高其产孢量，为后续开发地衣芽孢杆菌制剂（抗菌益生菌）打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
地衣芽孢杆菌T-1株由国家水生动物病原库筛选获得，保藏于中国微生物保藏中心，保藏编号CCTCC M2014049。LB培养基（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2）和LB液体培养基（蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4）自制，碳源（糖蜜、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麸皮粉和蛋白胨）、氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉、黄豆粉、KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）、无机盐（NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2）均为国产分析纯。主要仪器设备：超净工作台（SJ-CJ-1FD）、恒温培养箱（LHP-100）、高速冷冻离心机（KT7-900-430）、振荡培养箱（INNOVA 40R）、紫外分光光度计（UPG-722）和光照培养箱（MGC-350BP）。
1. 2 T-1株最佳培养条件的单因素试验
1. 2. 1 最佳培养温度 参考陈海超等（2018）的方法，将过夜培养菌液按1%比例接种到5 mL营养肉汤试管中（pH 7.0），分别置于20、24、28、32、37、42、46和50 ℃的摇床上振荡培养18 h后测OD600，确定T-1株生长的最佳温度。每个温度组设3个平行。
1. 2. 2 最佳pH 参考叶碧霞等（2017）的方法，用1 mol/L HCl或NaOH将培养基pH调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，将过夜培养菌液按1%比例接种到5 mL营养肉汤试管中，置于37 ℃摇床上振荡培养18 h后测OD600，确定T-1株生长的最佳pH。每个pH设3个平行。 1. 2. 3 最佳盐度 参照胡桂萍等（2018）的方法，将过夜培养菌液按1%比例接种到5 mL营养肉汤试管中（pH 7.0），按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%和8.0%的梯度盐度进行摇床振荡培养18 h后测OD600，确定T-1株生长的最佳盐度。每个盐度设3个平行。
1. 3 T-1株菌液OD600与活菌数量的关系
参考Ushakiranmayi等（2017）的方法，梯度稀释待测菌液10-3～10-7，取稀释菌液200 ?L均匀涂布于营养琼脂培养基上，每个梯度重复3次，培养24 h后统计活菌数。
1. 4 T-1株生长曲线绘制
参考叶碧霞等（2017）的方法，将T-1株的菌液按1%比例接种到营养肉汤培养基中，37 ℃下摇床培养。每4 h测量一次菌液OD600，以未接种菌液的培养基为空白对照，绘制T-1株培养时间与OD600的生长曲线。
1. 5 T-1株活菌数、芽孢数与时间的关系
活菌数测定参考叶碧霞等（2017）的方法，将T-1株菌液按1%比例接种到营养肉汤培养基中，37 ℃下摇床培养，采用稀释涂布法分别对培养4、8、12、16、20、24、36、48、60和72 h后的菌液进行活菌计数，每个梯度重复3次，测出各时段的活菌数。芽孢数测定参考Roy等（2013）的方法，将待测菌液置于80 ℃水浴锅中水浴15 min，然后按活菌计数方法进行计数，每个梯度重复3次，测量各时段的芽孢产量。
1. 6 发酵培养基组分单因素试验
1. 6. 1 最佳碳源筛选 分别选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、可溶性淀粉、麸皮粉和蛋白胨作为唯一碳源（1.0%），以牛肉浸粉为氮源（0.3%），装液量150 mL，接种量3%，37 ℃下摇床（150 r/min）培养54 h。按照碳源不同设8个试验组，每组3个平行，测量菌液OD600及其芽孢产量。
1. 6. 2 最佳氮源筛选 以最佳碳源为碳源（1.0%），选取5种有机氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉和黄豆粉）和4种无机氮源（KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）作为氮源（0.3%），装液量150 mL，接种量3%，37 ℃下摇床（150 r/min）培养54 h。按照碳源不同设9个试验组，每组3个平行，测量菌液OD600及其芽孢产量。
1. 6. 3 最佳无机盐筛选 在最佳碳源和氮源的基础上，选取NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2等7种无机盐（0.5%），装液量150 mL，接种量3%，37 ℃下摇床（150 r/min）培养54 h。按照无机盐不同设7个试验组，每组3个平行，测量菌液OD600及其芽孢产量。
1. 7 响应面分析法优化培养基成分及配比
1. 7. 1 Plackett-Burman试验设计 根据单因素试验结果，确定6个对芽孢产量影响较大的因子。采用Minitab 16.0中的Plackett-Burman试验设计筛选发酵培养基中影响芽孢产量的主要因子，依次设为X1（糖蜜）、X2（可溶性淀粉）、X3（酵母浸粉）、X4（CaCl2）、X5（搖床转速）和X6（接种量），每个因素取高低两个水平（El-Gherab et al.，2018）。
1. 7. 2 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman试验设计得出的一次拟合方程确定因素取值中心点，并确定主要因素的爬坡方向和变化步长;然后根据最陡爬坡试验中菌液芽孢产量的变化趋势，确定Box-Behnken试验设计的中心点及最适质量浓度范围（El-Gherab et al.，2018）。
1. 7. 3 响应面分析 根据最陡爬坡试验结果，确定Plackett-Burman试验设计中主要因素的最适质量浓度范围。采用Minitab 16.0中的Box-Behnken设计3因素优化试验，通过响应面分析各因素间的相互作用。
1. 8 统计分析
采用Excel 2010进行试验数据整理，利用Mini-tab 16.0对单因素试验结果和响应面分析结果进行方差分析，并通过最小显著性差异（LSD）进行多重比较。
2 结果与分析
2. 1 T-1株最佳发酵培养条件的单因素试验结果
由图1-A可看出，菌液OD600随培养温度的升高呈先升高后降低的变化趋势，于37 ℃时达最高值（0.425），即T-1株的最佳生长温度为37 ℃。由图1-B可看出，当pH由3.0逐渐上升至6.0时，菌液OD600随之升高，但pH继续上升后菌液OD600开始降低，说明T-1株适合在偏酸性环境下生长，最佳pH为6.0。由图1-C可看出，当培养基盐度为0.5%时，菌液OD600达最高值（0.453），但盐度继续增加时菌液OD600开始降低。由图1-D可看出，当菌液OD600大于0.859后菌液OD600与活菌数量间的关系趋于直线变化，当菌液OD600为1.604时，活菌数量达5.0×109 CFU/mL。
2. 2 T-1株活菌数和芽孢产量与培养时间的关系
由T-1株在37 ℃下摇床（150 r/min）培养的生长曲线（图2-A）可看出，0～4 h为菌株生长的迟缓期，4～24 h为对数增长期，24～48 h菌株生长达稳定期，48 h后为衰亡期。由图2-B可看出，T-1株的芽孢产量随摇床培养时间的延长逐步增加，即与培养时间呈正相关;培养至48 h后其活菌数呈下降趋势，而芽孢产量依然呈增加趋势。T-1株的活菌数在培养48～60 h期间其芽孢产量趋于稳定。
2. 3 T-1株最佳发酵培养基组分的单因素试验结果
2. 3. 1 最佳碳源筛选 以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、可溶性淀粉、麸皮粉和蛋白胨等8种碳源进行单因素试验，结果（表1）显示，可溶性淀粉组和葡萄糖组的菌液OD600较高，分别为1.308和1.200，而糖蜜组和可溶性淀粉组的芽孢产量较高，分别为1.28×108和1.66×108 CFU/mL。综合生产成本及培养效果，选取可溶性淀粉和糖蜜进行响应面分析。 2. 3. 2 最佳氮源筛选 选用5种有机氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉和黄豆粉）和4种无机氮源（KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）进行单因素试验，结果（表2）显示，酵母浸粉组的菌液OD600和芽孢产量均最高，分别为1.853和4.30×108 CFU/mL，因此选择酵母浸粉为最佳氮源。
2. 3. 3 最佳无机盐筛选 以可溶性淀粉为碳源、酵母浸粉为氮源，选择NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2等7种无机盐进行单因素试验，结果（表3）显示，CaCl2组的菌液OD600和芽孢产量均最高，分别为1.930和6.35×108 CFU/mL，因此选择CaCl2为最佳无机盐。
2. 4 响应面分析结果
2. 4. 1 Plackett-Burman试验结果 Plackett-Burman试验设计采用n=12，对6个因素（X1、X2、X3、X4、X5和X6）进行分析，并利用Minitab 16.0对试验结果（表4）进行统计分析，结果（表5）表明，X2（可溶性淀粉）对T-1株芽孢产量的影响达显著水平（P<0.05，下同），而X5（摇床转速）对芽孢产量的影响达极显著水平（P<0.01）。
2. 4. 2 最陡爬坡试验结果 由表5可知，X2（可溶性淀粉）对T-1株芽孢产量具有显著负效应，因此最陡爬坡试验应沿着可溶性淀粉浓度减少的方向进行设计;而X5（摇床转速）对T-1株芽孢产量具有极显著正效应，因此最陡爬坡试验应沿着转速升高的方向进行设计。最陡爬坡试验结果（表6）表明，在可溶性淀粉1.2%和摇床转速220 r/min附近区域时，T-1株的芽孢产量达最高值（27.7×108 CFU/mL）。
2. 4. 3 Box-Behnken中心组合试验结果 根据最陡爬坡试验结果（表6）设计Box-Behnken中心组合试验，其中可溶性淀粉和摇床转速的中心点分别为X1=1.2%和X2=220 r/min，具体因素水平设计见表7。对Box-Behnken中心组合试验结果（表8）进行方差分析，可知回归模型的决定系数为93.54%，P=0.000，失拟项P为0.764，表明拟合得到的回归模型显著且无失拟现象。由表9可知，回归模型的线性和平方对菌株芽孢产量的影响达显著水平，而交互作用对菌株芽孢产量的影响不显著;拟合得到的二次回归方程为Y芽孢产量=10.52+0.51X1-329.20X2-1.05X12-1.05X22+0.075X1X2。
利用响应优化器对拟合的二次回归方程进行求值（图4），得知当X1=1.11%、X2=218.43 r/min时，Y芽孢产量达最大值（10.59）。为进一步验证响应面分析结果，进行3次重复试验，结果显示T-1株芽孢产量的平均值为（10.52±4.50）×108 CFU/mL，与理论预测值相近，说明该回归模型预测结果可靠。与优化前采用初始基础培养基的T-1株芽孢产量（2.15×108 CFU/mL）相比，優化后的T-1株芽孢产量提高6.25倍。
3 讨论
抗生素是目前水产养殖行业常用的化学防治药物，但抗生素易使菌株产生耐药性，毒副作用强且存在环境污染等缺点，欧盟已于2006年全面停止使用抗生素作为饲料添加剂应用于水产养殖行业（倪军等，2018），即目前迫切需要一种新型安全绿色无污染的抗菌制剂来替代抗生素应用于水产养殖行业，尤其在生态环境和食品安全越来越受到重视的背景下，加快新型抗菌制剂的研制对促进水产养殖业健康发展具有重要意义。在本课题组前期的研究基础上，本研究采用单因素试验和响应面分析法对地衣芽孢杆菌T-1株的发酵培养条件进行优化，结果表明，以酵母浸粉为唯一氮源，T-1株的芽孢产量最高（4.30×108 CFU/mL），是由于酵母浸粉富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素和微量元素，与朱天辉等（2013）的研究结果一致;以CaCl2为唯一无机盐时，T-1株的芽孢产量明显高于其他无机盐，是由于Ca2+在细胞中控制其体内的渗透压，且Ca2+是某些生物酶的激活剂，能保障细胞正常的机体功能和酶活特性，与林陈强等（2011）的研究结果一致。
本研究基于单因素试验和Plackett-Burman试验，筛选出对T-1株芽孢产量影响显著的2个因素分别是可溶性淀粉和摇床转速，并通过最陡爬坡试验找出这2个因素的中心点，然后利用响应面分析法中的Box-Behnken中心组合试验设计筛选出最佳发酵培养条件。结合T-1株的生物学特性及其培养基优化条件，发现在温度37 ℃、pH 6.0、可溶性淀粉1.11%、酵母浸粉0.3%、CaCl2 0.5%、摇床转速218 r/min的条件下培养54 h，其芽孢产量为10.59×109 CFU/mL，较优化前初始基础培养基的菌株芽孢产量提高6.25倍。优化后的培养基能有效提高地衣芽孢杆菌T-1株发酵产孢数量，保证微生态制剂的含菌量;此外，优化筛选出的培养基是采用相对廉价且高效的原材料，有效节约了生产发酵成本，可在规模化生产上推广应用。
李冠杰等（2018）研究表明，地衣芽孢杆菌YDY株的最适发酵条件为培养温度 37 ℃、pH 8.0、接种量体积分数1%。王珊珊等（2018）研究发现，地衣芽孢杆菌LS-1株的最适培养条件为培养温度40 ℃、初始pH 12.0、接种量体积分数4%。在本研究的发酵培养条件下，地衣芽孢杆菌T-1株的生长对数期为4～24 h，即收集菌体的最佳时间为18～24 h，48 h后开始进入衰亡期，与刘莹等（2006）研究发现T-1株从培养21 h后进入衰亡期的结论相比，极大延长了地衣芽孢杆菌生长的稳定期。T-1株在温度37 ℃、摇床转速218 r/min的条件下培养48 h，其芽孢产量可达最大值，与解顺昌等（2015）的研究结果基本一致。可见，不同菌株的最佳发酵培养条件也不同，且差距较大，但具体原因有待进一步研究验证。 4 结论
具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株在优化后的发酵培养条件下，其芽孢产量较优化前明显提高6.25倍，且延长菌株生长的稳定期，加上优化筛选出的培养基是采用相对廉价且高效的原材料，有效节约了生产发酵成本，可在规模化生产上推广应用。
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（責任编辑 兰宗宝）