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[摘 要]目的 建立测定平喘贴中苦杏仁苷含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，用Inertsil ODS-3 C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇-1‰磷酸（体积比21∶79）为流动相；流速为1.0mL·min-1，检测波长为210nm。结果 在0.12～1.2μg范围内，峰面积与进样量的线性关系良好（r=0.9998），加样回收率为97.32%，RSD为1.07%。结论 该法简便、可靠、准确，结果满意。
[关键词]HPLC；平喘贴；苦杏仁苷；含量测定
中图分类号：R927.2文献标识码：A文章编号：1009-914X（2013）21-0251-01
平喘贴是以麻黄、杏仁等中药制成的外用制剂，具有宣肺散寒平喘、清热化痰止咳之功效，用于治疗止咳平喘等症。苦杏仁苷是苦杏仁中的主要有效成分。本文采用反相高效液相色谱法测定平喘贴中苦杏仁苷的含量，结果表明该法简便、准确、灵敏，可作为苦杏仁药材及其制剂的质量监控方法。
1 仪器与试药
Agilent-1100高效液相色谱仪，VWD检测器及其配套色谱工作站；苦杏仁苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：820-200201；平喘贴由湖北中医学院分析测试中心提供，所用蒸馏水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-1‰磷酸（体积比21∶79），流速：1.0mL·min-1，柱温：30℃，检测波长：210nm。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取在105℃干燥至恒重的苦杏仁苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.12mg的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
刮取贴膏1.0g，精密称定，置烧瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2mL，置中性氧化铝柱（100～200目，2g，内径1cm）上，用体积分数为50%的甲醇洗脱，收集洗脱液约9mL，置10mL容量瓶中，加磷酸1滴，用体积分数为50%的甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。
2.4 系统适应性试验
分别精密吸取对照品溶液6μL，供试品溶液5μL，注入液相色谱仪中测定。结果苦杏仁苷在20min内出峰，而且与前后的峰均有较好的分离，理论板数在3000以上。
按照本品制剂中的工艺制得除去苦杏仁的空白制剂，与供试品溶液色谱和苦杏仁对照品色谱比较，结果表明阴性样品无干扰。
2.5 线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下制备的对照品溶液1，4，6，8，10 μL，进样测定，以峰面积（A）为纵坐标，对苦杏仁苷含量（m）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=1323.276 m-9.71，r=0.9998，结果表明苦杏仁苷在0.12～1.2 μg的范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取“2.2”项下制备对照品溶液6μL，进样测定5次，测定峰面积，结果RSD=0.71%（n=5），表明精密度较好。
2.7 稳定性试验
分别精密吸取同一份供试品溶液5μL，于0、3、6、9、24h进样，测定其苦杏仁苷峰面积积分值，RSD=1.16%（n=5），表明样品在24h内稳定。
2.8 重复性试验
取同一批样品，精密称定5份，按“2.3”项方法制备，进样测定。结果平均含量为9.488mg·g-1，RSD=1.15%（n=5），表明方法重现性较好。
2.9 加样回收试验
取已知含量的样品约0.3g，精密称定，分别精密加入苦杏仁苷对照品溶液（1.0mg·mL-1）3mL，依法制备，测定并计算回收率，平均回收率为97.32%，RSD=1.07%。
2.10 样品测定
精密称取5批样品，分别按“2.3”项方法制备，测定。
5批样品平均含量为13.293mg/张。考虑到实验室样品的制备与工厂大规模生产的差异、药材产地、采收季节的差异，故把平均含量下浮20%，则含量限度可暂定为：本品含苦杏仁苷应不得低于10.6mg/张。
3 讨论
3.1 供试品制备方法的考察
分别精密吸取2mL甲醇溶液置1.5、2、2.5、3g中性氧化铝柱上，用体积分数为50%的甲醇洗脱，收集10mL洗脱液，加磷酸1滴，测定，结果显示2g的氧化铝效果最佳。分别精密吸取2mL甲醇溶液置2g中性氧化铝柱，用体积分数为50%的甲醇洗脱，分别收集5、10、15、20、25mL洗脱液，加磷酸1滴，测定，结果表明洗脱液10mL基本洗脱完全。并且考察不同提取时间，提取方法对苦杏仁苷含量的影响。结果采用回流提取1h效果较好。
3.2 流动相选择
曾以不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水作为流动相，结果发现流動相中加入乙腈峰形变差，而苦杏仁苷的龙胆双糖部分有较多的醇羟基，可加入H3PO4起离子抑制作用，甲醇-1‰磷酸溶液体系中苦杏仁苷与相邻峰达到基线分离，保留时间适宜，故选择其作为流动相。
3.3 柱温选择
曾考察柱温为25℃、30℃，结果发现柱温30℃时，苦杏仁苷和干扰成分可达到基线分离。复方中其他成分对苦杏仁苷测定无干扰。
参考文献
[1] 杨书斌，刘青，孙立立，等.HPLC测定苦杏仁饮片中苦杏仁苷的含量[J].中成药，2006，28（10）：1452-1454.
[2] 钟文，唐新，谢培德，等.HPLC测定止带消糜栓中苦杏仁苷的含量[J].中成药，2006，28（5）：766-767.
[关键词]HPLC；平喘贴；苦杏仁苷；含量测定
中图分类号：R927.2文献标识码：A文章编号：1009-914X（2013）21-0251-01
平喘贴是以麻黄、杏仁等中药制成的外用制剂，具有宣肺散寒平喘、清热化痰止咳之功效，用于治疗止咳平喘等症。苦杏仁苷是苦杏仁中的主要有效成分。本文采用反相高效液相色谱法测定平喘贴中苦杏仁苷的含量，结果表明该法简便、准确、灵敏，可作为苦杏仁药材及其制剂的质量监控方法。
1 仪器与试药
Agilent-1100高效液相色谱仪，VWD检测器及其配套色谱工作站；苦杏仁苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：820-200201；平喘贴由湖北中医学院分析测试中心提供，所用蒸馏水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-1‰磷酸（体积比21∶79），流速：1.0mL·min-1，柱温：30℃，检测波长：210nm。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取在105℃干燥至恒重的苦杏仁苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.12mg的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
刮取贴膏1.0g，精密称定，置烧瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2mL，置中性氧化铝柱（100～200目，2g，内径1cm）上，用体积分数为50%的甲醇洗脱，收集洗脱液约9mL，置10mL容量瓶中，加磷酸1滴，用体积分数为50%的甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。
2.4 系统适应性试验
分别精密吸取对照品溶液6μL，供试品溶液5μL，注入液相色谱仪中测定。结果苦杏仁苷在20min内出峰，而且与前后的峰均有较好的分离，理论板数在3000以上。
按照本品制剂中的工艺制得除去苦杏仁的空白制剂，与供试品溶液色谱和苦杏仁对照品色谱比较，结果表明阴性样品无干扰。
2.5 线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下制备的对照品溶液1，4，6，8，10 μL，进样测定，以峰面积（A）为纵坐标，对苦杏仁苷含量（m）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=1323.276 m-9.71，r=0.9998，结果表明苦杏仁苷在0.12～1.2 μg的范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取“2.2”项下制备对照品溶液6μL，进样测定5次，测定峰面积，结果RSD=0.71%（n=5），表明精密度较好。
2.7 稳定性试验
分别精密吸取同一份供试品溶液5μL，于0、3、6、9、24h进样，测定其苦杏仁苷峰面积积分值，RSD=1.16%（n=5），表明样品在24h内稳定。
2.8 重复性试验
取同一批样品，精密称定5份，按“2.3”项方法制备，进样测定。结果平均含量为9.488mg·g-1，RSD=1.15%（n=5），表明方法重现性较好。
2.9 加样回收试验
取已知含量的样品约0.3g，精密称定，分别精密加入苦杏仁苷对照品溶液（1.0mg·mL-1）3mL，依法制备，测定并计算回收率，平均回收率为97.32%，RSD=1.07%。
2.10 样品测定
精密称取5批样品，分别按“2.3”项方法制备，测定。
5批样品平均含量为13.293mg/张。考虑到实验室样品的制备与工厂大规模生产的差异、药材产地、采收季节的差异，故把平均含量下浮20%，则含量限度可暂定为：本品含苦杏仁苷应不得低于10.6mg/张。
3 讨论
3.1 供试品制备方法的考察
分别精密吸取2mL甲醇溶液置1.5、2、2.5、3g中性氧化铝柱上，用体积分数为50%的甲醇洗脱，收集10mL洗脱液，加磷酸1滴，测定，结果显示2g的氧化铝效果最佳。分别精密吸取2mL甲醇溶液置2g中性氧化铝柱，用体积分数为50%的甲醇洗脱，分别收集5、10、15、20、25mL洗脱液，加磷酸1滴，测定，结果表明洗脱液10mL基本洗脱完全。并且考察不同提取时间，提取方法对苦杏仁苷含量的影响。结果采用回流提取1h效果较好。
3.2 流动相选择
曾以不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水作为流动相，结果发现流動相中加入乙腈峰形变差，而苦杏仁苷的龙胆双糖部分有较多的醇羟基，可加入H3PO4起离子抑制作用，甲醇-1‰磷酸溶液体系中苦杏仁苷与相邻峰达到基线分离，保留时间适宜，故选择其作为流动相。
3.3 柱温选择
曾考察柱温为25℃、30℃，结果发现柱温30℃时，苦杏仁苷和干扰成分可达到基线分离。复方中其他成分对苦杏仁苷测定无干扰。
参考文献
[1] 杨书斌，刘青，孙立立，等.HPLC测定苦杏仁饮片中苦杏仁苷的含量[J].中成药，2006，28（10）：1452-1454.
[2] 钟文，唐新，谢培德，等.HPLC测定止带消糜栓中苦杏仁苷的含量[J].中成药，2006，28（5）：766-767.