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[摘 要]目的 建立测定平喘贴中苦杏仁苷含量的方法。方法 采用高效液相色谱法,用Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),以甲醇-1‰磷酸(体积比21∶79)为流动相;流速为1.0mL·min-1,检测波长为210nm。结果 在0.12~1.2μg范围内,峰面积与进样量的线性关系良好(r=0.9998),加样回收率为97.32%,RSD为1.07%。结论 该法简便、可靠、准确,结果满意。
[关键词]HPLC;平喘贴;苦杏仁苷;含量测定
中图分类号:R927.2文献标识码:A文章编号:1009-914X(2013)21-0251-01
平喘贴是以麻黄、杏仁等中药制成的外用制剂,具有宣肺散寒平喘、清热化痰止咳之功效,用于治疗止咳平喘等症。苦杏仁苷是苦杏仁中的主要有效成分。本文采用反相高效液相色谱法测定平喘贴中苦杏仁苷的含量,结果表明该法简便、准确、灵敏,可作为苦杏仁药材及其制剂的质量监控方法。
1 仪器与试药
Agilent-1100高效液相色谱仪,VWD检测器及其配套色谱工作站;苦杏仁苷对照品由中国药品生物制品检定所提供,批号:820-200201;平喘贴由湖北中医学院分析测试中心提供,所用蒸馏水为重蒸水;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-1‰磷酸(体积比21∶79),流速:1.0mL·min-1,柱温:30℃,检测波长:210nm。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取在105℃干燥至恒重的苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含0.12mg的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
刮取贴膏1.0g,精密称定,置烧瓶中,精密加入甲醇50mL,称定重量,回流提取1h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液2mL,置中性氧化铝柱(100~200目,2g,内径1cm)上,用体积分数为50%的甲醇洗脱,收集洗脱液约9mL,置10mL容量瓶中,加磷酸1滴,用体积分数为50%的甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
2.4 系统适应性试验
分别精密吸取对照品溶液6μL,供试品溶液5μL,注入液相色谱仪中测定。结果苦杏仁苷在20min内出峰,而且与前后的峰均有较好的分离,理论板数在3000以上。
按照本品制剂中的工艺制得除去苦杏仁的空白制剂,与供试品溶液色谱和苦杏仁对照品色谱比较,结果表明阴性样品无干扰。
2.5 线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下制备的对照品溶液1,4,6,8,10 μL,进样测定,以峰面积(A)为纵坐标,对苦杏仁苷含量(m)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程为:A=1323.276 m-9.71,r=0.9998,结果表明苦杏仁苷在0.12~1.2 μg的范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取“2.2”项下制备对照品溶液6μL,进样测定5次,测定峰面积,结果RSD=0.71%(n=5),表明精密度较好。
2.7 稳定性试验
分别精密吸取同一份供试品溶液5μL,于0、3、6、9、24h进样,测定其苦杏仁苷峰面积积分值,RSD=1.16%(n=5),表明样品在24h内稳定。
2.8 重复性试验
取同一批样品,精密称定5份,按“2.3”项方法制备,进样测定。结果平均含量为9.488mg·g-1,RSD=1.15%(n=5),表明方法重现性较好。
2.9 加样回收试验
取已知含量的样品约0.3g,精密称定,分别精密加入苦杏仁苷对照品溶液(1.0mg·mL-1)3mL,依法制备,测定并计算回收率,平均回收率为97.32%,RSD=1.07%。
2.10 样品测定
精密称取5批样品,分别按“2.3”项方法制备,测定。
5批样品平均含量为13.293mg/张。考虑到实验室样品的制备与工厂大规模生产的差异、药材产地、采收季节的差异,故把平均含量下浮20%,则含量限度可暂定为:本品含苦杏仁苷应不得低于10.6mg/张。
3 讨论
3.1 供试品制备方法的考察
分别精密吸取2mL甲醇溶液置1.5、2、2.5、3g中性氧化铝柱上,用体积分数为50%的甲醇洗脱,收集10mL洗脱液,加磷酸1滴,测定,结果显示2g的氧化铝效果最佳。分别精密吸取2mL甲醇溶液置2g中性氧化铝柱,用体积分数为50%的甲醇洗脱,分别收集5、10、15、20、25mL洗脱液,加磷酸1滴,测定,结果表明洗脱液10mL基本洗脱完全。并且考察不同提取时间,提取方法对苦杏仁苷含量的影响。结果采用回流提取1h效果较好。
3.2 流动相选择
曾以不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水作为流动相,结果发现流動相中加入乙腈峰形变差,而苦杏仁苷的龙胆双糖部分有较多的醇羟基,可加入H3PO4起离子抑制作用,甲醇-1‰磷酸溶液体系中苦杏仁苷与相邻峰达到基线分离,保留时间适宜,故选择其作为流动相。
3.3 柱温选择
曾考察柱温为25℃、30℃,结果发现柱温30℃时,苦杏仁苷和干扰成分可达到基线分离。复方中其他成分对苦杏仁苷测定无干扰。
参考文献
[1] 杨书斌,刘青,孙立立,等.HPLC测定苦杏仁饮片中苦杏仁苷的含量[J].中成药,2006,28(10):1452-1454.
[2] 钟文,唐新,谢培德,等.HPLC测定止带消糜栓中苦杏仁苷的含量[J].中成药,2006,28(5):766-767.
[关键词]HPLC;平喘贴;苦杏仁苷;含量测定
中图分类号:R927.2文献标识码:A文章编号:1009-914X(2013)21-0251-01
平喘贴是以麻黄、杏仁等中药制成的外用制剂,具有宣肺散寒平喘、清热化痰止咳之功效,用于治疗止咳平喘等症。苦杏仁苷是苦杏仁中的主要有效成分。本文采用反相高效液相色谱法测定平喘贴中苦杏仁苷的含量,结果表明该法简便、准确、灵敏,可作为苦杏仁药材及其制剂的质量监控方法。
1 仪器与试药
Agilent-1100高效液相色谱仪,VWD检测器及其配套色谱工作站;苦杏仁苷对照品由中国药品生物制品检定所提供,批号:820-200201;平喘贴由湖北中医学院分析测试中心提供,所用蒸馏水为重蒸水;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-1‰磷酸(体积比21∶79),流速:1.0mL·min-1,柱温:30℃,检测波长:210nm。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取在105℃干燥至恒重的苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含0.12mg的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
刮取贴膏1.0g,精密称定,置烧瓶中,精密加入甲醇50mL,称定重量,回流提取1h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液2mL,置中性氧化铝柱(100~200目,2g,内径1cm)上,用体积分数为50%的甲醇洗脱,收集洗脱液约9mL,置10mL容量瓶中,加磷酸1滴,用体积分数为50%的甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
2.4 系统适应性试验
分别精密吸取对照品溶液6μL,供试品溶液5μL,注入液相色谱仪中测定。结果苦杏仁苷在20min内出峰,而且与前后的峰均有较好的分离,理论板数在3000以上。
按照本品制剂中的工艺制得除去苦杏仁的空白制剂,与供试品溶液色谱和苦杏仁对照品色谱比较,结果表明阴性样品无干扰。
2.5 线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下制备的对照品溶液1,4,6,8,10 μL,进样测定,以峰面积(A)为纵坐标,对苦杏仁苷含量(m)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程为:A=1323.276 m-9.71,r=0.9998,结果表明苦杏仁苷在0.12~1.2 μg的范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取“2.2”项下制备对照品溶液6μL,进样测定5次,测定峰面积,结果RSD=0.71%(n=5),表明精密度较好。
2.7 稳定性试验
分别精密吸取同一份供试品溶液5μL,于0、3、6、9、24h进样,测定其苦杏仁苷峰面积积分值,RSD=1.16%(n=5),表明样品在24h内稳定。
2.8 重复性试验
取同一批样品,精密称定5份,按“2.3”项方法制备,进样测定。结果平均含量为9.488mg·g-1,RSD=1.15%(n=5),表明方法重现性较好。
2.9 加样回收试验
取已知含量的样品约0.3g,精密称定,分别精密加入苦杏仁苷对照品溶液(1.0mg·mL-1)3mL,依法制备,测定并计算回收率,平均回收率为97.32%,RSD=1.07%。
2.10 样品测定
精密称取5批样品,分别按“2.3”项方法制备,测定。
5批样品平均含量为13.293mg/张。考虑到实验室样品的制备与工厂大规模生产的差异、药材产地、采收季节的差异,故把平均含量下浮20%,则含量限度可暂定为:本品含苦杏仁苷应不得低于10.6mg/张。
3 讨论
3.1 供试品制备方法的考察
分别精密吸取2mL甲醇溶液置1.5、2、2.5、3g中性氧化铝柱上,用体积分数为50%的甲醇洗脱,收集10mL洗脱液,加磷酸1滴,测定,结果显示2g的氧化铝效果最佳。分别精密吸取2mL甲醇溶液置2g中性氧化铝柱,用体积分数为50%的甲醇洗脱,分别收集5、10、15、20、25mL洗脱液,加磷酸1滴,测定,结果表明洗脱液10mL基本洗脱完全。并且考察不同提取时间,提取方法对苦杏仁苷含量的影响。结果采用回流提取1h效果较好。
3.2 流动相选择
曾以不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水作为流动相,结果发现流動相中加入乙腈峰形变差,而苦杏仁苷的龙胆双糖部分有较多的醇羟基,可加入H3PO4起离子抑制作用,甲醇-1‰磷酸溶液体系中苦杏仁苷与相邻峰达到基线分离,保留时间适宜,故选择其作为流动相。
3.3 柱温选择
曾考察柱温为25℃、30℃,结果发现柱温30℃时,苦杏仁苷和干扰成分可达到基线分离。复方中其他成分对苦杏仁苷测定无干扰。
参考文献
[1] 杨书斌,刘青,孙立立,等.HPLC测定苦杏仁饮片中苦杏仁苷的含量[J].中成药,2006,28(10):1452-1454.
[2] 钟文,唐新,谢培德,等.HPLC测定止带消糜栓中苦杏仁苷的含量[J].中成药,2006,28(5):766-767.