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【摘要】目的 研究体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUECV304）在间断性高浓度胰岛素与持续性高浓度胰岛素作用下诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白的不同表达，从而进一步研究间断性高浓度胰岛素血症导致动脉粥样硬化的原因及发病机制。方法培养人脐静脉内皮细胞（HUECV304）为实验对象，研究间断性高浓度胰岛素对血管内皮细胞iNOS蛋白表达的影响。分为四组进行实验，即间断性高浓度胰岛素波动组（含100 nmol/L胰岛素的细胞培养液及含1 nmol/L胰岛素的细胞培养液轮换，每隔8小时更换一次）、持续性高浓度胰岛素组（含100 nmol/L胰岛素的细胞培养液）、含正常浓度胰岛素组（含1 nmol/L胰岛素的细胞培养液）、阴性对照组（不含胰岛素的细胞培养液）；再依次更换新鲜条件细胞培养液（每次培育8小时后），四组细胞均培育72小时。采用免疫细胞化学法检测内皮细胞iNOS蛋白表达。结果四组内皮细胞经含不同浓度胰岛素的培养液培养72小时后，结果表明：正常浓度胰岛素组、间断性高浓度胰岛素组、持续性高浓度胰岛素组的内皮细胞iNOS蛋白的表达水平均不同程度地增高，分别为对照组的1.92倍（P<0.001）、4.52倍（P<0.001）、3.31倍（P<0.001），其中以间断性高浓度胰岛素组增高幅度尤为明显，高于持续性高浓度胰岛素组（P<0.001）。结论相对于持续性高浓度胰岛素，间断性高浓度胰岛素更能增强人脐静脉内皮细胞iNOS蛋白的表达，提示间断性高浓度胰岛素可能通过影响血管内皮细胞iNOS蛋白表达途径而损伤血管内皮的功能，从而促进糖尿病血管并发症的进一步发展。
【关键词】 间断性高浓度胰岛素；人脐静脉内皮细胞；诱导型一氧化氮合酶；蛋白表达
中图分类号：R587.3 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.01.003
高胰岛素血症是国内外糖尿病及高血压患者因心血管疾病死亡的重要原因[1，2] 。目前认为糖尿病患者发生动脉粥样硬化的危险性与高血糖、高胰岛素血症、异常脂血症等众多病理因素有关。有临床研究表明在肥胖和超重儿童中有高胰岛素血症者占总人数的44.7%[3]。因为胰岛素抵抗而产生随之而来的高胰岛素血症存在于许多疾病中，是糖尿病早期的症状之一[4]。而且基础动物研究发现，使孕期怀孕大鼠血压升高的主要原因为高胰岛素血症[5]。但高胰岛素血症如何导致动脉粥样硬化发生的病理机制至今尚未完全阐明。目前许多学者认为内皮细胞功能受损是众多血管性疾病发生的始动步骤。因此，深入开展高胰岛素血症致内皮功能损伤机理的研究将有利于进一步阐明糖尿病动脉粥样硬化的发病机制。有研究表明：通过免疫炎症反应高浓度胰岛素参与动脉粥样硬化的发生[6]。鉴于内皮细胞一氧化氮（NO）分泌的异常变化是内皮细胞受损的最早期表现并且加入炎症反应，且诱导型一氧化氮合酶（iNOS）与炎症反应相关。考虑糖尿病（2型）是一种慢性炎症性疾病，很多炎症因子加入2型糖尿病的发生及其并发症的发展[7，8]。所以我们研究含不同高浓度胰岛素形成的间断性高浓度胰岛素培养液培养下的内皮细胞iNOS蛋白水平表达，与含持续性高浓度胰岛素细胞培养液培养下的内皮细胞iNOS蛋白水平表达有何不同的影响，旨在进一步探索间断性高胰岛素血症促进动脉粥样硬化发生及发展的病理生理机制，进而为糖尿病血管并发症的防治及胰岛素的合理应用开辟新的途径。1材料与方法1.1实验材料和试剂 自通化东宝药业股份有限公司购重组人胰岛素（甘舒霖R）；自中南大学湘雅医学院细胞典藏中心购内皮细胞株（HUECV304）细胞；自杭州四季青公司购胎牛血清（FBS）和新生牛血清；自Gibco公司购DMEM细胞培养基（低糖型）；其他试剂均为国产分析纯产品。
1.2实验方法和步骤
1.2.1内皮细胞的传代培养及鉴定先将HUECV304放入含5%二氧化碳的37℃（持续恒温）细胞培养箱内培养。等待细胞长成亚融合状态时，再用1～2 ml 0.25%胰蛋白酶消化细胞3～5 min，待细胞消化至皱缩、彼此分离抑或呈大片状分离形态时即吸去消化液，再滴入适当量的含20%胎牛血清的细胞培养液用来终止细胞消化。然后，将大片状分离细胞吹打成单细胞悬液，待计数后用无菌吸管按1×105/ml等量吸取细胞至新的细胞无菌培养瓶中继续培养，将细胞静止培养4～6小时，待细胞固定后再更换培养液，用倒置相差显微镜观察新生代细胞的形态特点。用Ⅷ因子抗原免疫细胞化学检测（+）方法鉴定实验细胞为内皮细胞株，待细胞生长至80%融合后，取生长状态好的对数生长期细胞用于实验。
1.2.2实验分组及处理取生长良好的对数期内皮细胞用于实验，待细胞接近融合时，为了使细胞同步，四组均换上不含血清的DMEM细胞培养液继续培育一天，再换用低糖型DMEM条件培养液培养。实验分组如下：①间断性高浓度胰岛素组（含1 nmol/L胰岛素及100 nmol/L胰岛素两种条件培养液，每间隔8小时更换1次条件培养液，简称间断性高浓度胰岛素组）；②持续性高浓度胰岛素组（含100 nmol/L胰岛素）；③正常浓度胰岛素组（含1 nmol/L胰岛素）；④阴性对照组（不含胰岛素），按照时间更换一次新鲜条件培养液（每间隔8小时），共培育细胞72小时后行相关指标检测。
1.2.3应用SP试剂盒免疫细胞化学检测iNOS基因蛋白表达水平 （1）先将传代细胞加入已放入盖玻片的6孔培养板中培养，当细胞长至50%～60%融合时，再加入条件培养液继续培养细胞72小时。（2）吸出条件培养液后先用PBS冲洗5次，再使用95%酒精固定30 min。（3）水化：先用无水乙醇作用3次，每次5 min；再用95%乙醇作用3次，每次5 min，然后用75%乙醇作用3次，每次5 min。（4）加入hydrogen peroxide 室温阻滞10～15 min，然后用001 M平衡盐缓冲液冲洗细胞4次，每次冲洗5 min。（5）加入ULtra Ⅴ阻断剂，室温阻滞5 min，再0.01 M平衡盐缓冲液冲洗4次，每次5 min。（6）加入一抗（兔抗人iNOS抗体），于4℃过夜，再用0.01 M平衡盐缓冲液冲洗4次，每次5 min。（7）加入二抗（羊抗兔）室温孵育10 min后用0.01 M PBS缓冲液冲洗4次，每次5 min。（8）加入streptavidin peroxidase，室温培养10 min，再用0.01 M平衡盐缓冲液冲洗细胞4次，每次5 min。（9）加DAB显色剂至细胞培养板中，将细胞培养板室温孵育，显微镜下观察，5～15 min（视染色深浅而定）后，再用001 M平衡盐缓冲液冲洗4次，每次5 min。（10）再加入1%HCl 70%酒精淡化及二甲苯透明。（11）用酒精脱水：先用75%乙醇脱水3次，每次5 min，再用95%乙醇脱水3次，每次5 min，最后用无水乙醇脱水3次，每次5 min。（12）最后晾干，用中性树脂封片保存。 1.2.4结果判定 细胞膜及胞质内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性染色，细胞中未出现黄色或棕黄色颗粒为阴性染色。最后均采用Image J 1.34软件进行分析处理所有图像资料。
1.3统计学方法 建立数据均采用SPSS 13.0统计软件，用均数±标准差（±s）表示计量数据，资料符合正态分布及方差齐性，用单向方差分析法（Oneway ANOVA）进行组间比较，P<005为差异有统计学意义。
2结果待不同浓度胰岛素组处理内皮细胞72小时后，用免疫细胞化学方法检测iNOS蛋白表达水平，结果提示：正常浓度组、间断性高浓度胰岛素组、持续性高浓度胰岛素组的内皮细胞iNOS蛋白的表达水平均呈现不同程度的增加，分别为对照组的1.92倍（P<0001）、4.52倍（P<0001）及3.31倍（P<0001）。其中以间断性高浓度胰岛素组增高幅度尤为明显，且与持续性高浓度胰岛素组相比差异有统计学意义（P<0001）。各组内皮细胞图像见图1A～D。对各组细胞的免疫细胞化学图像采用Image J 134图像分析软件进行分析，结果见表1。
图1各组内皮细胞图像（SP法：×400）。A： 阴性对照组；B：正常浓度胰岛
素组；C：持续性高浓度胰岛素组；D：间断性高浓度胰岛素组。
3讨论高胰岛素血症是心血管疾病及糖尿病、高血压病等多种疾病的病理生理基础[9]，所以目前临床内分泌学已有大量研究关注高胰岛素血症与动脉粥样硬化的关系。许多临床研究表明，内源性高胰岛素
表1各组iNOS蛋白表达 （n=3，±s）
组别iNOS蛋白阴性对照组10.3±0.8正常浓度胰岛素组 19.8±0.7a持续性高浓度胰岛素组34.1±1.0ab间断性高浓度胰岛素组46.6±1.3abcF799.31P0.000注：与阴性对照组比较，aP<0.001；与正常浓度胰岛素组比较，bP<0.001；与持续性高浓度胰岛素组比较，cP<0.001。
血症产生的原因为肥胖所导致的内源性胰岛素抵抗[10]。高胰岛素血症出现于高血压及冠心病患者及其一级亲属中[11]。有临床研究显示，2型糖尿病并肥胖患者因胰岛素抵抗具有内源性高胰岛素血症，1型糖尿病患者产生高胰岛素血症的原因是因为需要注射胰岛素降糖治疗[12]。2型糖尿病并肥胖患者体内空腹胰岛素水平异常增高（因为存在胰岛素抵抗）；在应用口服刺激β细胞分泌降血糖药后又会人为地造成餐后高胰岛素血症；而1型糖尿病患者需要外源性胰岛素治疗，由于胰岛素治疗往往超过人正常胰岛素分泌量才有治疗效果，加上注射的胰岛素不需先通过肝脏代谢而是直接进入人体循环，使得糖尿病患者全天某时段或全天外周血管血浆胰岛素水平总高于生理浓度，从而导致使用外源性胰岛素治疗的2型及1型糖尿病患者伴发的冠状动脉事件发生率大幅度升高[13]。提示无论是外源性还是内源性高胰岛素血症，均可能在糖尿病患者动脉粥样硬化的发生及发展过程中具有十分重要的作用。然而，对高胰岛素血症是如何诱发及促进动脉粥样硬化的病理机制目前尚缺乏深入了解。血管内皮功能障碍是糖尿病患者发生多种心血管疾病共同的病理生理改变。因此对高胰岛素血症导致内皮功能障碍的原理及其发生机理的研究具有重要意义。近年来研究表明，内皮细胞损伤在动脉粥样硬化的发生发展中起非常重要的基础作用。动物研究表明在内皮细胞胰岛素抵抗的小鼠容易出现明显的动脉粥样硬化[14]。内皮依赖性胰岛素抵抗可导致内皮细胞活性氧增加，引起血管舒张功能障碍。同样胰岛素还可通过影响iNOS基因表达的多态性进而影响内皮功能[15]。临床研究表明存在胰岛素抵抗的糖尿病患者，每天由于进食、口服刺激β细胞分泌胰岛素的降糖药及注射外源性胰岛素等因素，导致血浆胰岛素水平会出现空腹高胰岛素状态及餐后高胰岛素状态，并不可能长期维持稳定浓度的高胰岛素状态，血浆胰岛素水平总会在一定浓度水平范围出现频繁的异常波动形态，导致间断性高浓度胰岛素血症。然而间断性高浓度胰岛素血症对血管内皮细胞的影响尚未见报道，故本实验研究间断性高浓度胰岛素对iNOS蛋白表达的影响，以阐明间断性高浓度胰岛素血症导致血管内皮损害的可能机制。我们的研究发现，经含不同浓度胰岛素的培养液培养内皮细胞72小时后，正常浓度胰岛素组、间断性高浓度胰岛素组及持续性高浓度胰岛素组的内皮细胞iNOS蛋白的表达水平均出现不同程度的增加，分别为对照组的1.92倍（P<0.001）、4.52倍（P<0.001）及3.31倍（P<0.001），以间断性高浓度胰岛素组上调幅度尤为明显，显著高于持续性高浓度胰岛素组（P<0.001）。
综上所述，本研究首次提出了间断性高浓度胰岛素血症的概念，并对间断性高浓度胰岛素对血管内皮细胞功能的影响进行了研究。结果显示：间断性高浓度胰岛素相对于持续性高浓度胰岛素更能上调iNOS蛋白表达，表明间断性高浓度胰岛素血症可能是一种重要的致动脉粥样硬化的危险因素。因此这不仅仅为糖尿病患者发生动脉粥样硬化提供相应的理论基础，而且可能为指导糖尿病患者的合理胰岛素治疗提供临床依据。同时提示我们在临床实践中，不仅仅要防止形成空腹及餐后高胰岛素血症，而且要尽量避免体内血浆胰岛素处于频繁波动状态，这可能对延缓糖尿病血管病变的发生及发展有着十分重要的基础及临床意义。参考文献[1] Lastra G，Dhuper S，Johnson MS，et al.Salt，aldosterone，and insulin resistance：impact on the cardiovascular system[J].Nat Rev Cardiol，2010，7（10）：577584.
[2] De Filippo G，Rendina D，Strazzullo P.Childhood obesity，other cardiovascular risk factors，and premature death[J].N Engl J Med，2010，362（19）：18411842. [3] A1Agha A，Ochehree A，Shata N.Prevalence of hyperinsulinism，type 2 diabetes mellitus and metabolic syndrome among Saudi overwelght and obese pediatric patients[J].Minerva Pediatr，2012，64（6）：623631.
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（收稿日期：2014-12-17修回日期：2015-01-27）
（编辑：潘明志）
【关键词】 间断性高浓度胰岛素；人脐静脉内皮细胞；诱导型一氧化氮合酶；蛋白表达
中图分类号：R587.3 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.01.003
高胰岛素血症是国内外糖尿病及高血压患者因心血管疾病死亡的重要原因[1，2] 。目前认为糖尿病患者发生动脉粥样硬化的危险性与高血糖、高胰岛素血症、异常脂血症等众多病理因素有关。有临床研究表明在肥胖和超重儿童中有高胰岛素血症者占总人数的44.7%[3]。因为胰岛素抵抗而产生随之而来的高胰岛素血症存在于许多疾病中，是糖尿病早期的症状之一[4]。而且基础动物研究发现，使孕期怀孕大鼠血压升高的主要原因为高胰岛素血症[5]。但高胰岛素血症如何导致动脉粥样硬化发生的病理机制至今尚未完全阐明。目前许多学者认为内皮细胞功能受损是众多血管性疾病发生的始动步骤。因此，深入开展高胰岛素血症致内皮功能损伤机理的研究将有利于进一步阐明糖尿病动脉粥样硬化的发病机制。有研究表明：通过免疫炎症反应高浓度胰岛素参与动脉粥样硬化的发生[6]。鉴于内皮细胞一氧化氮（NO）分泌的异常变化是内皮细胞受损的最早期表现并且加入炎症反应，且诱导型一氧化氮合酶（iNOS）与炎症反应相关。考虑糖尿病（2型）是一种慢性炎症性疾病，很多炎症因子加入2型糖尿病的发生及其并发症的发展[7，8]。所以我们研究含不同高浓度胰岛素形成的间断性高浓度胰岛素培养液培养下的内皮细胞iNOS蛋白水平表达，与含持续性高浓度胰岛素细胞培养液培养下的内皮细胞iNOS蛋白水平表达有何不同的影响，旨在进一步探索间断性高胰岛素血症促进动脉粥样硬化发生及发展的病理生理机制，进而为糖尿病血管并发症的防治及胰岛素的合理应用开辟新的途径。1材料与方法1.1实验材料和试剂 自通化东宝药业股份有限公司购重组人胰岛素（甘舒霖R）；自中南大学湘雅医学院细胞典藏中心购内皮细胞株（HUECV304）细胞；自杭州四季青公司购胎牛血清（FBS）和新生牛血清；自Gibco公司购DMEM细胞培养基（低糖型）；其他试剂均为国产分析纯产品。
1.2实验方法和步骤
1.2.1内皮细胞的传代培养及鉴定先将HUECV304放入含5%二氧化碳的37℃（持续恒温）细胞培养箱内培养。等待细胞长成亚融合状态时，再用1～2 ml 0.25%胰蛋白酶消化细胞3～5 min，待细胞消化至皱缩、彼此分离抑或呈大片状分离形态时即吸去消化液，再滴入适当量的含20%胎牛血清的细胞培养液用来终止细胞消化。然后，将大片状分离细胞吹打成单细胞悬液，待计数后用无菌吸管按1×105/ml等量吸取细胞至新的细胞无菌培养瓶中继续培养，将细胞静止培养4～6小时，待细胞固定后再更换培养液，用倒置相差显微镜观察新生代细胞的形态特点。用Ⅷ因子抗原免疫细胞化学检测（+）方法鉴定实验细胞为内皮细胞株，待细胞生长至80%融合后，取生长状态好的对数生长期细胞用于实验。
1.2.2实验分组及处理取生长良好的对数期内皮细胞用于实验，待细胞接近融合时，为了使细胞同步，四组均换上不含血清的DMEM细胞培养液继续培育一天，再换用低糖型DMEM条件培养液培养。实验分组如下：①间断性高浓度胰岛素组（含1 nmol/L胰岛素及100 nmol/L胰岛素两种条件培养液，每间隔8小时更换1次条件培养液，简称间断性高浓度胰岛素组）；②持续性高浓度胰岛素组（含100 nmol/L胰岛素）；③正常浓度胰岛素组（含1 nmol/L胰岛素）；④阴性对照组（不含胰岛素），按照时间更换一次新鲜条件培养液（每间隔8小时），共培育细胞72小时后行相关指标检测。
1.2.3应用SP试剂盒免疫细胞化学检测iNOS基因蛋白表达水平 （1）先将传代细胞加入已放入盖玻片的6孔培养板中培养，当细胞长至50%～60%融合时，再加入条件培养液继续培养细胞72小时。（2）吸出条件培养液后先用PBS冲洗5次，再使用95%酒精固定30 min。（3）水化：先用无水乙醇作用3次，每次5 min；再用95%乙醇作用3次，每次5 min，然后用75%乙醇作用3次，每次5 min。（4）加入hydrogen peroxide 室温阻滞10～15 min，然后用001 M平衡盐缓冲液冲洗细胞4次，每次冲洗5 min。（5）加入ULtra Ⅴ阻断剂，室温阻滞5 min，再0.01 M平衡盐缓冲液冲洗4次，每次5 min。（6）加入一抗（兔抗人iNOS抗体），于4℃过夜，再用0.01 M平衡盐缓冲液冲洗4次，每次5 min。（7）加入二抗（羊抗兔）室温孵育10 min后用0.01 M PBS缓冲液冲洗4次，每次5 min。（8）加入streptavidin peroxidase，室温培养10 min，再用0.01 M平衡盐缓冲液冲洗细胞4次，每次5 min。（9）加DAB显色剂至细胞培养板中，将细胞培养板室温孵育，显微镜下观察，5～15 min（视染色深浅而定）后，再用001 M平衡盐缓冲液冲洗4次，每次5 min。（10）再加入1%HCl 70%酒精淡化及二甲苯透明。（11）用酒精脱水：先用75%乙醇脱水3次，每次5 min，再用95%乙醇脱水3次，每次5 min，最后用无水乙醇脱水3次，每次5 min。（12）最后晾干，用中性树脂封片保存。 1.2.4结果判定 细胞膜及胞质内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性染色，细胞中未出现黄色或棕黄色颗粒为阴性染色。最后均采用Image J 1.34软件进行分析处理所有图像资料。
1.3统计学方法 建立数据均采用SPSS 13.0统计软件，用均数±标准差（±s）表示计量数据，资料符合正态分布及方差齐性，用单向方差分析法（Oneway ANOVA）进行组间比较，P<005为差异有统计学意义。
2结果待不同浓度胰岛素组处理内皮细胞72小时后，用免疫细胞化学方法检测iNOS蛋白表达水平，结果提示：正常浓度组、间断性高浓度胰岛素组、持续性高浓度胰岛素组的内皮细胞iNOS蛋白的表达水平均呈现不同程度的增加，分别为对照组的1.92倍（P<0001）、4.52倍（P<0001）及3.31倍（P<0001）。其中以间断性高浓度胰岛素组增高幅度尤为明显，且与持续性高浓度胰岛素组相比差异有统计学意义（P<0001）。各组内皮细胞图像见图1A～D。对各组细胞的免疫细胞化学图像采用Image J 134图像分析软件进行分析，结果见表1。
图1各组内皮细胞图像（SP法：×400）。A： 阴性对照组；B：正常浓度胰岛
素组；C：持续性高浓度胰岛素组；D：间断性高浓度胰岛素组。
3讨论高胰岛素血症是心血管疾病及糖尿病、高血压病等多种疾病的病理生理基础[9]，所以目前临床内分泌学已有大量研究关注高胰岛素血症与动脉粥样硬化的关系。许多临床研究表明，内源性高胰岛素
表1各组iNOS蛋白表达 （n=3，±s）
组别iNOS蛋白阴性对照组10.3±0.8正常浓度胰岛素组 19.8±0.7a持续性高浓度胰岛素组34.1±1.0ab间断性高浓度胰岛素组46.6±1.3abcF799.31P0.000注：与阴性对照组比较，aP<0.001；与正常浓度胰岛素组比较，bP<0.001；与持续性高浓度胰岛素组比较，cP<0.001。
血症产生的原因为肥胖所导致的内源性胰岛素抵抗[10]。高胰岛素血症出现于高血压及冠心病患者及其一级亲属中[11]。有临床研究显示，2型糖尿病并肥胖患者因胰岛素抵抗具有内源性高胰岛素血症，1型糖尿病患者产生高胰岛素血症的原因是因为需要注射胰岛素降糖治疗[12]。2型糖尿病并肥胖患者体内空腹胰岛素水平异常增高（因为存在胰岛素抵抗）；在应用口服刺激β细胞分泌降血糖药后又会人为地造成餐后高胰岛素血症；而1型糖尿病患者需要外源性胰岛素治疗，由于胰岛素治疗往往超过人正常胰岛素分泌量才有治疗效果，加上注射的胰岛素不需先通过肝脏代谢而是直接进入人体循环，使得糖尿病患者全天某时段或全天外周血管血浆胰岛素水平总高于生理浓度，从而导致使用外源性胰岛素治疗的2型及1型糖尿病患者伴发的冠状动脉事件发生率大幅度升高[13]。提示无论是外源性还是内源性高胰岛素血症，均可能在糖尿病患者动脉粥样硬化的发生及发展过程中具有十分重要的作用。然而，对高胰岛素血症是如何诱发及促进动脉粥样硬化的病理机制目前尚缺乏深入了解。血管内皮功能障碍是糖尿病患者发生多种心血管疾病共同的病理生理改变。因此对高胰岛素血症导致内皮功能障碍的原理及其发生机理的研究具有重要意义。近年来研究表明，内皮细胞损伤在动脉粥样硬化的发生发展中起非常重要的基础作用。动物研究表明在内皮细胞胰岛素抵抗的小鼠容易出现明显的动脉粥样硬化[14]。内皮依赖性胰岛素抵抗可导致内皮细胞活性氧增加，引起血管舒张功能障碍。同样胰岛素还可通过影响iNOS基因表达的多态性进而影响内皮功能[15]。临床研究表明存在胰岛素抵抗的糖尿病患者，每天由于进食、口服刺激β细胞分泌胰岛素的降糖药及注射外源性胰岛素等因素，导致血浆胰岛素水平会出现空腹高胰岛素状态及餐后高胰岛素状态，并不可能长期维持稳定浓度的高胰岛素状态，血浆胰岛素水平总会在一定浓度水平范围出现频繁的异常波动形态，导致间断性高浓度胰岛素血症。然而间断性高浓度胰岛素血症对血管内皮细胞的影响尚未见报道，故本实验研究间断性高浓度胰岛素对iNOS蛋白表达的影响，以阐明间断性高浓度胰岛素血症导致血管内皮损害的可能机制。我们的研究发现，经含不同浓度胰岛素的培养液培养内皮细胞72小时后，正常浓度胰岛素组、间断性高浓度胰岛素组及持续性高浓度胰岛素组的内皮细胞iNOS蛋白的表达水平均出现不同程度的增加，分别为对照组的1.92倍（P<0.001）、4.52倍（P<0.001）及3.31倍（P<0.001），以间断性高浓度胰岛素组上调幅度尤为明显，显著高于持续性高浓度胰岛素组（P<0.001）。
综上所述，本研究首次提出了间断性高浓度胰岛素血症的概念，并对间断性高浓度胰岛素对血管内皮细胞功能的影响进行了研究。结果显示：间断性高浓度胰岛素相对于持续性高浓度胰岛素更能上调iNOS蛋白表达，表明间断性高浓度胰岛素血症可能是一种重要的致动脉粥样硬化的危险因素。因此这不仅仅为糖尿病患者发生动脉粥样硬化提供相应的理论基础，而且可能为指导糖尿病患者的合理胰岛素治疗提供临床依据。同时提示我们在临床实践中，不仅仅要防止形成空腹及餐后高胰岛素血症，而且要尽量避免体内血浆胰岛素处于频繁波动状态，这可能对延缓糖尿病血管病变的发生及发展有着十分重要的基础及临床意义。参考文献[1] Lastra G，Dhuper S，Johnson MS，et al.Salt，aldosterone，and insulin resistance：impact on the cardiovascular system[J].Nat Rev Cardiol，2010，7（10）：577584.
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（收稿日期：2014-12-17修回日期：2015-01-27）
（编辑：潘明志）