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【摘要】目的建立一种用HPLC法测定老鹳草中没食子酸的含量。方法采用phenomen ODS C18柱（5μm，4.6mm×250mm）（天津菲罗门公司），以甲醇-0.1%H3PO4（4：96）为流动相，检测波长为268nm，流速为1.0mL/min。结果样品中没食子酸分离度、峰形较好，且线性关系良好，加样回收率为99.05%，RSD为0.351%。结论本方法操作简单，结果准确，可以有效地控制质量。
【关键词】老鹳草；没食子酸；HPLC
文章编号：1004-7484（2013）-01-0367-01
老鹳草为传统中药，味苦，凉、钝、腻、糙。具有活血、调经之功效。主治妇血症、月经不调、闭经、经期腹痛等。多入丸散剂，也是蒙医常用药。其单味制剂老鹳草软膏有消炎解毒、收敛生肌的作用。但其化学成分却不明确，本文对其中含有的没食子酸進行了系统研究。
1仪器与试药
1.1仪器Shimadazu-10AVP高效液相色谱仪系统；CLASS-VPver6.1色谱工作站；KQ3200DB型数控超声波清洗器；澳大利亚产Centra-10e型UV-可见分光光度计。
1.2试药甲醇（Fisher，色谱纯），双蒸水，其余试剂均为分析纯。没食子酸对照品（批号：110831-200302，供含量测定用，中国药品生物制品检定所）。样品来源：赤峰（敖汉旗）、赤峰（翁牛特旗）、乌拉山、蛮汗山。药材经内蒙古医学院药学院庞秀生教授鉴定。
2色谱条件
phenomen ODS C18柱（5μm，4.6mm×250mm，天津菲罗门公司）；流动相为甲醇-0.1%H3PO4（4：96）；检测波长为268nm；流速为1.0mL/min；柱温28℃；进样量20μL；面积外标法定量。
3方法与结果
3.1供试品溶液的制备取样品约0.9g，精密称定，置定量滤纸中包好置索氏提取器中，加入150mL无水氯仿，回流2h，连同滤纸取出药材，并挥干氯仿，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇50mL，称定重量，置超声仪中超声提取30分钟，放冷，称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
3.2对照品溶液的制备取经五氧化二磷真空干燥置恒重的没食子酸对照品1.7mg，精密称定，置10mL量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，再精密吸2.0mL置25.0mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL中含没食子酸13.6μg）。
3.3检测波长的选择取没食子酸对照品溶液，用Centra-10e-UV分光光度计在波长200nm-400nm范围内进行光谱扫描，由吸收曲线可见，没食子酸有两个最大吸收波长，分别为226nm和268nm，考虑到共存成分的干扰问题，确定以268nm为检测波长。
3.4系统适用性试验取供试品溶液、没食子酸对照品溶液和溶剂空白，在上述色谱条件下进样20μL，测绘HPLC图谱。可见，空白溶剂在没食子酸出峰时间区域没有干扰峰出现，故对没食子酸的测定无干扰作用，在与没食子酸对照品的保留时间相对应的位置上供试品具有色谱峰，且与相邻峰的分离度大于1.5，理论塔板数按没食子酸峰计算为8900，没食子酸对称因子在1.0-1.04之间。
3.5线性关系的考察取经五氧化二磷真空干燥置恒重的没食子酸对照品4mg，精密称定，置25mL量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，再精密吸4.0mL置25.0mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取0.8、1.6，2.4，3.0，3.6，4.0mL，置5mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度。按上述色谱条件，分别进样20μL，记录峰面积，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，没食子酸量（X：μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，计算，得回归方程Y=67386X-5+33791，r=0.9999。结果表明，没食子酸在0.0813μg-0.4065μg之间呈良好的线性关系。
3.6精密度试验取供试品一份（赤峰敖汉旗7月10日采集样品），按“3.1供试品溶液制备方法”制备供试品溶液，重复进样5次，记录没食子酸峰面积积分值和保留时间（tR）。
3.7稳定性试验取供试品一份（赤峰敖汉旗7月10日采集样品），按“3.1供试品溶液制备方法”制备供试品溶液，在常温下放置12h，每隔2h测定一次。结果表明，供试品溶液在12h内稳定。
3.8重复性实验取同一批号供试品（赤峰敖汉旗7月10日采集样品）5份，按“3.1供试品溶液制备方法”制备成供试品溶液。分别按【含量测定】项下方法操作并测定每份的含量。RSD为0.76%，符合要求。
3.9回收率试验取同一批号供试品（赤峰敖汉旗7月10日采集样品）5份，每份约0.45g，精密称定，分别精密加入一定量的没食子酸对照品，混匀。按“3.1供试品溶液制备方法”制备成供试品溶液。分别按【含量测定】项下方法操作并测定每份的含量，计算回收率，RSD为0.35%，符合要求。
4讨论
4.1流动相的选择本实验通过分别采用不同系统的流动相进行测试比较，结果样品中的没食子酸在甲醇-0.1%H3PO4（4：96）系统中分离度好，无干扰。故采用甲醇-0.1%H3PO4（4：96）作为流动相。
4.2提取溶剂的选择本实验通过分别采用100%、80%、60%甲醇为溶剂对老鹳草样品进行了提取，并按含量测定方法的测定供试品溶液中没食子酸的含量。结果用60%和50%甲醇提取时，提取效率较高，但干扰较大。本法根据没食子酸不溶于氯仿的性质，先采用无水氯仿先脱脂，再用50%甲醇提取，可降低干扰。
4.3提取时间的选择经实验对超声20、30、40分钟的结果进行了比较，以超声30分钟含量较高。
【关键词】老鹳草；没食子酸；HPLC
文章编号：1004-7484（2013）-01-0367-01
老鹳草为传统中药，味苦，凉、钝、腻、糙。具有活血、调经之功效。主治妇血症、月经不调、闭经、经期腹痛等。多入丸散剂，也是蒙医常用药。其单味制剂老鹳草软膏有消炎解毒、收敛生肌的作用。但其化学成分却不明确，本文对其中含有的没食子酸進行了系统研究。
1仪器与试药
1.1仪器Shimadazu-10AVP高效液相色谱仪系统；CLASS-VPver6.1色谱工作站；KQ3200DB型数控超声波清洗器；澳大利亚产Centra-10e型UV-可见分光光度计。
1.2试药甲醇（Fisher，色谱纯），双蒸水，其余试剂均为分析纯。没食子酸对照品（批号：110831-200302，供含量测定用，中国药品生物制品检定所）。样品来源：赤峰（敖汉旗）、赤峰（翁牛特旗）、乌拉山、蛮汗山。药材经内蒙古医学院药学院庞秀生教授鉴定。
2色谱条件
phenomen ODS C18柱（5μm，4.6mm×250mm，天津菲罗门公司）；流动相为甲醇-0.1%H3PO4（4：96）；检测波长为268nm；流速为1.0mL/min；柱温28℃；进样量20μL；面积外标法定量。
3方法与结果
3.1供试品溶液的制备取样品约0.9g，精密称定，置定量滤纸中包好置索氏提取器中，加入150mL无水氯仿，回流2h，连同滤纸取出药材，并挥干氯仿，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇50mL，称定重量，置超声仪中超声提取30分钟，放冷，称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
3.2对照品溶液的制备取经五氧化二磷真空干燥置恒重的没食子酸对照品1.7mg，精密称定，置10mL量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，再精密吸2.0mL置25.0mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL中含没食子酸13.6μg）。
3.3检测波长的选择取没食子酸对照品溶液，用Centra-10e-UV分光光度计在波长200nm-400nm范围内进行光谱扫描，由吸收曲线可见，没食子酸有两个最大吸收波长，分别为226nm和268nm，考虑到共存成分的干扰问题，确定以268nm为检测波长。
3.4系统适用性试验取供试品溶液、没食子酸对照品溶液和溶剂空白，在上述色谱条件下进样20μL，测绘HPLC图谱。可见，空白溶剂在没食子酸出峰时间区域没有干扰峰出现，故对没食子酸的测定无干扰作用，在与没食子酸对照品的保留时间相对应的位置上供试品具有色谱峰，且与相邻峰的分离度大于1.5，理论塔板数按没食子酸峰计算为8900，没食子酸对称因子在1.0-1.04之间。
3.5线性关系的考察取经五氧化二磷真空干燥置恒重的没食子酸对照品4mg，精密称定，置25mL量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，再精密吸4.0mL置25.0mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取0.8、1.6，2.4，3.0，3.6，4.0mL，置5mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度。按上述色谱条件，分别进样20μL，记录峰面积，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，没食子酸量（X：μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，计算，得回归方程Y=67386X-5+33791，r=0.9999。结果表明，没食子酸在0.0813μg-0.4065μg之间呈良好的线性关系。
3.6精密度试验取供试品一份（赤峰敖汉旗7月10日采集样品），按“3.1供试品溶液制备方法”制备供试品溶液，重复进样5次，记录没食子酸峰面积积分值和保留时间（tR）。
3.7稳定性试验取供试品一份（赤峰敖汉旗7月10日采集样品），按“3.1供试品溶液制备方法”制备供试品溶液，在常温下放置12h，每隔2h测定一次。结果表明，供试品溶液在12h内稳定。
3.8重复性实验取同一批号供试品（赤峰敖汉旗7月10日采集样品）5份，按“3.1供试品溶液制备方法”制备成供试品溶液。分别按【含量测定】项下方法操作并测定每份的含量。RSD为0.76%，符合要求。
3.9回收率试验取同一批号供试品（赤峰敖汉旗7月10日采集样品）5份，每份约0.45g，精密称定，分别精密加入一定量的没食子酸对照品，混匀。按“3.1供试品溶液制备方法”制备成供试品溶液。分别按【含量测定】项下方法操作并测定每份的含量，计算回收率，RSD为0.35%，符合要求。
4讨论
4.1流动相的选择本实验通过分别采用不同系统的流动相进行测试比较，结果样品中的没食子酸在甲醇-0.1%H3PO4（4：96）系统中分离度好，无干扰。故采用甲醇-0.1%H3PO4（4：96）作为流动相。
4.2提取溶剂的选择本实验通过分别采用100%、80%、60%甲醇为溶剂对老鹳草样品进行了提取，并按含量测定方法的测定供试品溶液中没食子酸的含量。结果用60%和50%甲醇提取时，提取效率较高，但干扰较大。本法根据没食子酸不溶于氯仿的性质，先采用无水氯仿先脱脂，再用50%甲醇提取，可降低干扰。
4.3提取时间的选择经实验对超声20、30、40分钟的结果进行了比较，以超声30分钟含量较高。