构建一种由缺氧反应元件(hypoxia responsive element, HRE)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus－thymidine kinase, HSV－TK)基因的真核表达载体，观察HRE能否增强HSV－TK/GCV(gancyclovir，GCV)系统对乏氧环境中的人Ewing′s肉瘤细胞系SK－ES细胞的杀伤作用，为弥补放、化疗的不足，探索有效的治疗方法。

(1)将合成的HRE片断，插入到pIRES₂－EGFP(pIRES₂－EGFP)的双顺反子荧光蛋白报告基因的真核启动子的增强子部位，获得重组质粒pHRE；以PCR法扩增HSV－TK基因中TK基因片断，将其克隆到pIRES₂－EGFP及pHRE的双顺反子荧光蛋白报告基因上游的多克隆位点，获得重组质粒pTK及pHRE－TK。(2)通过脂质体将pHRE－TK、pHRE、pTK及pIRES₂－EGFP导入SK－ES细胞，分别在乏氧(O₂浓度为3%)和富氧(O₂浓度为21%)环境中培养，荧光显微镜观察报告基因增强性绿色荧光蛋白表达变化，并进行荧光吸光度分析；再予以GCV处理5 d后，用MTT法检测GCV对培养细胞的杀伤效果。

(1)测序结果证实，重组质粒pHRE含HRE片断，pTK及pHRE－TK含HSV－TK片断，均为单拷贝正向插入，序列正确。(2)对比各组细胞EGFP荧光吸光度值发现：①在乏氧环境中培养，pHRE和pHRE－TK组细胞荧光吸光度值高于在富氧环境培养的荧光吸光度值(P<0.01)；②在乏氧环境培养，pHRE组和pHRE－TK组细胞荧光吸光度值高于pTK组和pIRES₂－EGFP组(P<0.01)；③在富氧环境培养的各组细胞之间荧光吸光度值差异无统计学意义(P>0.05)。(3)对比GCV对各组细胞杀伤效果发现：①在乏氧、富氧两种环境培养的pHRE－TK和pTK组细胞对GCV的敏感性均高于pHRE组细胞(P<0.01)，敏感性随GCV浓度增加而增大；②在乏氧环境培养的pHRE－TK组细胞对GCV的敏感性高于pTK组(P<0.01)，而在富氧环境中培养的pHRE－TK组与pTK组细胞对GCV的敏感性差异无统计学意义(P>0.05)；③在乏氧环境培养的pHRE－TK组细胞对GCV的敏感性高于在富氧环境中培养的pHRE－TK组细胞(P<0.01)；而在乏氧、富氧两种环境培养的pTK组细胞对GCV的敏感性差异无统计学意义(P>0.05)。

(1)成功地构建了含有HRE及HSV－TK基因片断的真核表达载体。(2)在缺氧的SK－ES细胞内，HRE使报告基因EGFP表达增强。(3)HRE能增强HSV－TK/ GCV系统对乏氧环境中的SK－ES细胞的杀伤效率。