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随着医学分子生物学、细胞生物学及高分子材料学的快速发展，使干细胞技术运用于临床成为可能，再生医学的研究内容就是如何将干细胞发育成组织并应用这种潜能进行组织替代疗法，从而恢复受损组织的正常结构和功能[1]。再生医学的研究，都是围绕干细胞而展开的，其中间充质干细胞由于其分离培养简便，具有自我更新能力和多分化潜能等优点，受到了最多的关注。早在1966年，Friedenstein[2]首次描述了使用骨髓来源的间充质干细胞在组织中进行培养。之后Caplan[3]发现这种细胞在各间质谱系中具有分化潜能，并将这类细胞命名为间充质干细胞。间充质干细胞具有分化为血液、骨、软骨、脂肪、肌肉、表皮、上皮、神经等组织的潜能，在组织再生和创伤修复过程中发挥着重要作用，同时也是再生医学研究中最重要的种子细胞[4]。在干细胞研究中，细胞体外培养是必不可少的步骤，其中细胞微环境是影响其生物学行为的重要因素，培养所需的最适氧张力被认为是微环境的重要组成部分。生理氧张力在不同的组织中各不相同，在血液中约为12%，而在深部的软骨组织低至1%[5]，在骨髓中氧的张力被认为在4%～7%[6]之间或者低至1%～2%[7-8]。目前均认为，细胞在体内的氧张力低于大气中的氧张力（21%）。早在1958年，Cooper等[9]发现在低于常氧的条件下培养细胞时，某些细胞的增殖能力更强。此外机体也常会有病理性低氧状态，如心脏骤停后由于缺氧造成组织缺血问题。近些年低氧在再生医学领域的研究倍受关注[10-12]。本文结合相关文献全面综述了低氧对间充质干细胞生物学行为的影响及其相关分子机制，试图摸索细胞最适培养环境。通过控制细胞培养的氧浓度为更好地培养间充质干细胞，并使其在再生医学的运用中达到预期的成果提供依据。
1 低氧对间充质干细胞凋亡的影响
将细胞植入到缺血部位后，细胞在长期修复应答反应中的存活能力对再生医学来说非常重要。Geng等[13]将MSCs注入到心肌梗塞的小鼠心室，4天后检测到99%的MSCs死亡。也有文献报道MSCs运用于椎间疾病[14-15]或软骨修复[16]中的远期死亡较少。在缺氧环境中，细胞并不依赖三磷酸腺苷（ATP）氧化磷酸化所提供能量，因为这条通路在氧的环境进行。而糖酵解作用并不需要氧的参与，因此该通路为缺氧下的细胞提供能量。Zhu等[17]的研究中将MSC置于3%的低氧及无血清条件下（模拟缺血环境）培养，细胞中半胱天冬蛋白酶-3（caspase-3）活性增高，发生依赖caspase的凋亡，但是单独的低氧条件并不能增高caspase-3的活性，诱导凋亡的效应不明显。该研究结果表明，MSC对低氧缺血的环境敏感，但导致其凋亡的主要因素不为低氧。细胞通过转录因子的作用对氧起反应，最重要的影响因子是低氧诱导因子－1α（hypoxic inducible foctor-1,HIF-1α）。HIF-1α在常氧下被降解，在低氧条件下稳定表达[18]。Greijer等[19]的实验表明，低氧的严重程度决定着细胞凋亡，0.5%的氧可以启动细胞的凋亡，在此过程中涉及HIF-1诱导血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）的表达升高，若抑制VEGF的表达，细胞凋亡数增加。
尽管间充质干细胞能在缺血的组织中存活几天，但我们需要的是长期存活能力。在低氧下预培养MSCs能增强细胞移植到体内后的存活率[20]。这些都是经过一系列复杂的信号通路后所产生的减少细胞凋亡的有利结果。由于低氧可增强Akt基因蛋白表达，孔宏亮等[21]将转染和未转染Akt基因的大鼠骨髓间充质干细胞置于1%的氧浓度培养，发现转染Akt基因的间充质干细胞能减少低氧时的凋亡和提高缺氧时的增殖能力。
2 低氧对间充质干细胞增殖的影响
生理健康组织的氧体积分数大多都低于常氧，骨髓也处于低于常氧的环境中，而间充质干细胞主要来源于骨髓。相关研究表明，在生理氧张力范围下培养间充质干细胞能促进其增殖。Lennon等[6]在低于5%的氧中培养小鼠的MSCs，发现其增殖率相对常氧下培养大约多出40%。Grayson等[22-23]的实验也得到相同的结论，他们将氧体积分数降至2%时，在三维支架中培养出的细胞比常氧下培养出的细胞数量明显增加，并且他们发现在三维支架中培养的细胞初期时显示出一个长时间的延迟期，但在培养23天后其增殖率仍比常氧下高出许多倍。Grayson等认为在低氧下培养间充质干细胞并不能使其短时间内迅速增殖，而是使细胞增殖的持续时间被延长了，表明低氧是在培养后期（G2/S/M）维持其增殖速率。对于间充质干细胞在低于常氧下培养是在短期内还是在培养后期提高其增殖率，研究者的结果各不相同。Rosova等[24]将细胞置于1%氧中培养16h，没有发现细胞在短期内迅速增殖；Hung等[25]将人的骨髓间充质干细胞用17%的牛血清培养液，并放在1%的氧中培养，发现细胞的短期增殖率较低。以上的研究结果与Grayson等相符。相反的，Martin-Rendon等[26]将细胞置于1.5%的氧中培养，发现在短期内迅速促进细胞周期的进行，提高细胞的增殖。
总之，在生理范围内的低氧下无论是单独培养间充质干细胞还是在三维支架中培养，都能促进其增殖效率。不论通过扩增其增殖能力还是降低其倍增的时间都与氧的浓度及细胞的类型和其他的培养条件相关。低氧下改变细胞增殖的内在机制目前仍不明确，Yun等[27]认为是雌二醇-17β的作用。在低氧下，Oct-4和Rex-1的表达水平都更高，提示低氧能维持早期间充质干细胞表型，在低氧下也可能是通过上调HIF-1α或HIF-2α的活性来促进间充质干细胞的增殖[28]。
3 低氧对间充质干细胞分化的影响
成人体内软骨祖细胞自我再生能力较弱，MSCs分化为软骨对软骨的再生有重大意义。体内软骨所处的氧环境低于常氧，MSCs在形成软骨的过程中，氧浓度对其代谢起着重要的调节作用。目前，关于低氧对间充质干细胞向软骨、成骨分化的作用结果并不一致。有些学者认为低氧对MSCs成软骨、成骨分化作用无明显影响，Scherer等[29]将MSCs置于5%的氧培养时发现低氧并没有抑制细胞向软骨分化，但细胞成软骨分化能力也未见明显增强。Salim等[30]将细胞置于2%的氧与常氧下培养时，细胞向成骨分化的能力未见明显差异，但是当氧体积分数为0.02%时，细胞向成骨分化的能力减弱；另一些学者认为低氧能促进MSCs向软骨、成骨分化，Wang等[31]将MSCs分别置于体积分数为5%的氧与常氧下培养时，发现在低氧条件下细胞分泌大量与软骨相关的基质分子，其中胶原合成率较常氧下明显增加，促进软骨分化。Lennon等[6]将细胞置于5%的氧与常氧下培养时，发现一直在低氧下培养的细胞向成骨分化的能力比在常氧下培养强。D＇Ippolito等[28]的研究得出完全不同的结论，他们认为在低氧下或经低氧预处理后的细胞向成骨分化的能力比常氧下降低。Potier等[32]则认为间充质干细胞成骨分化的影响因素不仅与不同程度的低氧有关，还可能与暴露于低氧环境的时间长短有关。
干细胞向软骨、成骨分化的信号通路仍不是很明确，在少有的相关报道中，Kanichai等[33]的研究试图说明细胞分化为软骨的相关机制，他们认为软骨分化受一系列转录因子操纵，其中Sox家族的作用最为明显，可能是因为低氧激活HIF-1，进而活化Sox-9，使骨髓间充质干细胞软骨相关基质分泌增多，从而促进细胞成软骨化。
[32]Potier E,Ferreira E,Andriamanalijaona R,et al.Hypoxia affects mesenchymal stromal cell osteogenic differentiation and angiogenic factor expression[J].Bone,2007,40(4):1078-1086.
[33]Kanichai M,Ferguson D,Prenderqast PJ,et al.Hypoxia promotes chondrogenesis in rat messenchymal stem cells:a role for AKT and hypoxia-inducible factor(HIF)-1alpha[J].J Cell Physiol,2008,216(3):708-715.
[34]Barbash IM,Chouraqui P,Baron J,et al.Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium:feasibility,cell migration,and body distribution[J].Circulation,2003,108(7):863-868.
[35]Ji JF,He BP,Dheen ST,et al.Expression of chemokine receptors CXCR4,CCR2,CCR5 and CX3CR1 in neural progenitor cells isolated from the subventricular zone of the adult rat brain[J].Neurosci Lett,2004,355(3):236-240.
[36]Ma Q,Jones D,Borqhesani PR,et al.Impaired B-lymphopoiesis,myelopoiesis,and derailed cerebellar neuron migration in CXCR4- and SDF-1-deficientmice[J].Proc Natl Acad Sci USA ,1998,95(16):9448-9453.
[37]Tepper OM,Galiano RD,Capla JM,et al.Human endothelial progenitor cells from typeⅡ diabteics exbibit impaired proliferation,adhesion,and incorporation into vascular structures[J].Circulation,2002,106(22):2781-2786.
[38]李士勇,邓宇斌.SDF-1/CXCR4轴在缺氧缺血性脑损伤中的研究进展[J].生命科学,2008,20(3):463-466.
[39]王心蕊,何 旭,王医术,等.低氧促进人骨髓间充质干细胞迁移的实验研究[J].中国免疫学杂志,2006,22(12):1100-1102.
[40]Stellos K,LangerH,Daub K,et al.Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promtoes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells[J].Circulation,2008,117(2):206-215.
[收稿日期]2011-10-24 [修回日期]2011-11-18
编辑/李阳利
1 低氧对间充质干细胞凋亡的影响
将细胞植入到缺血部位后，细胞在长期修复应答反应中的存活能力对再生医学来说非常重要。Geng等[13]将MSCs注入到心肌梗塞的小鼠心室，4天后检测到99%的MSCs死亡。也有文献报道MSCs运用于椎间疾病[14-15]或软骨修复[16]中的远期死亡较少。在缺氧环境中，细胞并不依赖三磷酸腺苷（ATP）氧化磷酸化所提供能量，因为这条通路在氧的环境进行。而糖酵解作用并不需要氧的参与，因此该通路为缺氧下的细胞提供能量。Zhu等[17]的研究中将MSC置于3%的低氧及无血清条件下（模拟缺血环境）培养，细胞中半胱天冬蛋白酶-3（caspase-3）活性增高，发生依赖caspase的凋亡，但是单独的低氧条件并不能增高caspase-3的活性，诱导凋亡的效应不明显。该研究结果表明，MSC对低氧缺血的环境敏感，但导致其凋亡的主要因素不为低氧。细胞通过转录因子的作用对氧起反应，最重要的影响因子是低氧诱导因子－1α（hypoxic inducible foctor-1,HIF-1α）。HIF-1α在常氧下被降解，在低氧条件下稳定表达[18]。Greijer等[19]的实验表明，低氧的严重程度决定着细胞凋亡，0.5%的氧可以启动细胞的凋亡，在此过程中涉及HIF-1诱导血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）的表达升高，若抑制VEGF的表达，细胞凋亡数增加。
尽管间充质干细胞能在缺血的组织中存活几天，但我们需要的是长期存活能力。在低氧下预培养MSCs能增强细胞移植到体内后的存活率[20]。这些都是经过一系列复杂的信号通路后所产生的减少细胞凋亡的有利结果。由于低氧可增强Akt基因蛋白表达，孔宏亮等[21]将转染和未转染Akt基因的大鼠骨髓间充质干细胞置于1%的氧浓度培养，发现转染Akt基因的间充质干细胞能减少低氧时的凋亡和提高缺氧时的增殖能力。
2 低氧对间充质干细胞增殖的影响
生理健康组织的氧体积分数大多都低于常氧，骨髓也处于低于常氧的环境中，而间充质干细胞主要来源于骨髓。相关研究表明，在生理氧张力范围下培养间充质干细胞能促进其增殖。Lennon等[6]在低于5%的氧中培养小鼠的MSCs，发现其增殖率相对常氧下培养大约多出40%。Grayson等[22-23]的实验也得到相同的结论，他们将氧体积分数降至2%时，在三维支架中培养出的细胞比常氧下培养出的细胞数量明显增加，并且他们发现在三维支架中培养的细胞初期时显示出一个长时间的延迟期，但在培养23天后其增殖率仍比常氧下高出许多倍。Grayson等认为在低氧下培养间充质干细胞并不能使其短时间内迅速增殖，而是使细胞增殖的持续时间被延长了，表明低氧是在培养后期（G2/S/M）维持其增殖速率。对于间充质干细胞在低于常氧下培养是在短期内还是在培养后期提高其增殖率，研究者的结果各不相同。Rosova等[24]将细胞置于1%氧中培养16h，没有发现细胞在短期内迅速增殖；Hung等[25]将人的骨髓间充质干细胞用17%的牛血清培养液，并放在1%的氧中培养，发现细胞的短期增殖率较低。以上的研究结果与Grayson等相符。相反的，Martin-Rendon等[26]将细胞置于1.5%的氧中培养，发现在短期内迅速促进细胞周期的进行，提高细胞的增殖。
总之，在生理范围内的低氧下无论是单独培养间充质干细胞还是在三维支架中培养，都能促进其增殖效率。不论通过扩增其增殖能力还是降低其倍增的时间都与氧的浓度及细胞的类型和其他的培养条件相关。低氧下改变细胞增殖的内在机制目前仍不明确，Yun等[27]认为是雌二醇-17β的作用。在低氧下，Oct-4和Rex-1的表达水平都更高，提示低氧能维持早期间充质干细胞表型，在低氧下也可能是通过上调HIF-1α或HIF-2α的活性来促进间充质干细胞的增殖[28]。
3 低氧对间充质干细胞分化的影响
成人体内软骨祖细胞自我再生能力较弱，MSCs分化为软骨对软骨的再生有重大意义。体内软骨所处的氧环境低于常氧，MSCs在形成软骨的过程中，氧浓度对其代谢起着重要的调节作用。目前，关于低氧对间充质干细胞向软骨、成骨分化的作用结果并不一致。有些学者认为低氧对MSCs成软骨、成骨分化作用无明显影响，Scherer等[29]将MSCs置于5%的氧培养时发现低氧并没有抑制细胞向软骨分化，但细胞成软骨分化能力也未见明显增强。Salim等[30]将细胞置于2%的氧与常氧下培养时，细胞向成骨分化的能力未见明显差异，但是当氧体积分数为0.02%时，细胞向成骨分化的能力减弱；另一些学者认为低氧能促进MSCs向软骨、成骨分化，Wang等[31]将MSCs分别置于体积分数为5%的氧与常氧下培养时，发现在低氧条件下细胞分泌大量与软骨相关的基质分子，其中胶原合成率较常氧下明显增加，促进软骨分化。Lennon等[6]将细胞置于5%的氧与常氧下培养时，发现一直在低氧下培养的细胞向成骨分化的能力比在常氧下培养强。D＇Ippolito等[28]的研究得出完全不同的结论，他们认为在低氧下或经低氧预处理后的细胞向成骨分化的能力比常氧下降低。Potier等[32]则认为间充质干细胞成骨分化的影响因素不仅与不同程度的低氧有关，还可能与暴露于低氧环境的时间长短有关。
干细胞向软骨、成骨分化的信号通路仍不是很明确，在少有的相关报道中，Kanichai等[33]的研究试图说明细胞分化为软骨的相关机制，他们认为软骨分化受一系列转录因子操纵，其中Sox家族的作用最为明显，可能是因为低氧激活HIF-1，进而活化Sox-9，使骨髓间充质干细胞软骨相关基质分泌增多，从而促进细胞成软骨化。
[32]Potier E,Ferreira E,Andriamanalijaona R,et al.Hypoxia affects mesenchymal stromal cell osteogenic differentiation and angiogenic factor expression[J].Bone,2007,40(4):1078-1086.
[33]Kanichai M,Ferguson D,Prenderqast PJ,et al.Hypoxia promotes chondrogenesis in rat messenchymal stem cells:a role for AKT and hypoxia-inducible factor(HIF)-1alpha[J].J Cell Physiol,2008,216(3):708-715.
[34]Barbash IM,Chouraqui P,Baron J,et al.Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium:feasibility,cell migration,and body distribution[J].Circulation,2003,108(7):863-868.
[35]Ji JF,He BP,Dheen ST,et al.Expression of chemokine receptors CXCR4,CCR2,CCR5 and CX3CR1 in neural progenitor cells isolated from the subventricular zone of the adult rat brain[J].Neurosci Lett,2004,355(3):236-240.
[36]Ma Q,Jones D,Borqhesani PR,et al.Impaired B-lymphopoiesis,myelopoiesis,and derailed cerebellar neuron migration in CXCR4- and SDF-1-deficientmice[J].Proc Natl Acad Sci USA ,1998,95(16):9448-9453.
[37]Tepper OM,Galiano RD,Capla JM,et al.Human endothelial progenitor cells from typeⅡ diabteics exbibit impaired proliferation,adhesion,and incorporation into vascular structures[J].Circulation,2002,106(22):2781-2786.
[38]李士勇,邓宇斌.SDF-1/CXCR4轴在缺氧缺血性脑损伤中的研究进展[J].生命科学,2008,20(3):463-466.
[39]王心蕊,何 旭,王医术,等.低氧促进人骨髓间充质干细胞迁移的实验研究[J].中国免疫学杂志,2006,22(12):1100-1102.
[40]Stellos K,LangerH,Daub K,et al.Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promtoes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells[J].Circulation,2008,117(2):206-215.
[收稿日期]2011-10-24 [修回日期]2011-11-18
编辑/李阳利