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[摘 要]根据高压液相色谱（HPLC）分离基本原理以及分子结构相似的有机物在反相色谱柱的保留时间与其正辛醇-水分配系数（Kow）直接的对数线性相关关系，可以设计一套液相色谱实验教学方案。与传统的HPLC教学实验方案设计不同，本方案重点在于让学习者从本质上掌握液相色谱分离的基本原理和有机物的保留规律。
[关键词]高压液相色谱（HPLC） 正辛醇-水分配系数（Kow） 相关性分析 实验设计
[中图分类号] G642.423 [文献标识码] A [文章编号] 2095-3437（2014）17-0160-03
液相色谱分析是仪器分析的重要手段之一，在现代有机物分析中发挥了巨大的作用。液相色谱分析教学也成为大学化学、生物、药学、环境科学、食品科学等诸多专业的《仪器分析》课程中的重要内容。随着我国经济的发展，各普通高校相关专业的实验条件得到改善，在《仪器分析》配套实验课程中逐步开设了高压液相色谱（HPLC）实验，有的甚至在专门的《色谱》课程配套实验中分不同类型、目的多方案开设实验。传统的HPLC教学实验常常选择一种到三种有机物作为对象，在一定色谱条件下进行色谱分离与定性定量检测，评估分离与分析的性能。然而，多年的教学经验让我们发现一个问题，学习过的学生甚至高年级的研究生并不能初步判断不同有机物在反相HPLC上的保留特性的差异，而且往往对色谱分离原理在HPLC的实现机制缺少应有的基本认知。这促使我们设计了一套新的液相色谱实验教学，即双酚类有机物的Kow测定。
一、实验原理
色谱法是一种借助色谱分离原理而使混合物中各组分分离的技术，它是混合物非常有效的分离、分析方法。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。图1给出了HPLC的基本组成与结构。
①流动相储液瓶；②溶剂脱气机；③梯度阀；④混合器；⑤高压泵；⑥六通阀；⑦定量环；⑧保护住；⑨色谱柱；⑩紫外检测器；{11}数据采集系统；{12}废液收集瓶。[1]
待测有机组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K表示，即：
分配系数是色谱分离的依据。常用的分配系数是正辛醇-水分配系数Kow，即：
式中：CO、CW分别为有机物在正辛醇相和水相中的平衡浓度。Kow不同，保留时间亦不同。现已积累了大量有机化合物的Kow值，是量化表征有机化合物疏水性的方法之一。[2]
USEPA根据Kow与色谱保留时间t的对数线性相关性[如方程（3）所示]，建立了基于反相HPLC保留时间t测定有机物Kow的标准方法。[3]
log Kow= a log t + b （3）
该标准方法中高效液相色谱法采用C-18反相色谱柱，流动相为甲醇-水混合液。本实验采用高效液相色谱法测定双酚类一系列结构相似的有机化合物的保留时间，通过考察保留时间与Kow之间的关系来进一步理解色谱法的原理，掌握基本实验操作和数据分析方法。本实验设计中选择的系列有机物是双酚类有机物，包括七种，其结构与名称如图2所示。
二、实验试剂及仪器
双酚类有机物BPA、TDP、BPAP、BPCH、BPP、TMBPA、BPC的稀溶液；高效液相色谱仪：安捷伦1200（低压四元梯度HPLC系统的组成见图1），压力：200kg / cm2；流速：1.0mL / min；二极管阵列紫外检测器；色谱柱：Kromasil 100-5C18，150×4.6mm。流动相甲醇-水混合液（80%甲醇∶20%水），20微升定量环。也可采用手动进样模式的HPLC。
三、实验步骤
1.按体积比配制80%的甲醇溶液，超声20min除去溶液中溶解的气体，用微孔滤膜过滤后即可作为流动相使用。
2.打开高效液相色谱仪，设置仪器参数：流速=1mL / min；检测波长λ=280nm；在工作站中设置样品的相关参数：样品名称、检测时间、文件指定的保存目录等。参数设好以后开泵脱气（每次更换新的流动相都要进行脱气操作），脱气完毕后测试基线。
3.待基线平稳以后，将配好的BPA等一系列双酚类有机物的稀溶液用进样针从进样口依次进样，设定每一次的检测时间为10min，记录各样品的出峰时间t，单位min。
4.样品测定完后，关闭紫外检测器。用超纯水进样，清洗进样器中残留的样品，用100%甲醇流动相冲洗色谱柱约30min，关闭高压泵。
四、实验结果及数据处理
（一）实验结果记录
在表1中记录七种双酚类有机物在HPLC上的保留时间t，同时查阅现有的化学物质安全手册（MSDS）或其他工具书，或者利用Chemiffice软件获得这些双酚类有机物的Kow，计算其对数，列于表1。
注：t为用液谱法测得的相应物质的保留时间；Kow由Chemoffice软件获得。
（二）确定log t与log Kow的关系
利用Origin软件（或者其他科学数据处理软件）作log t-log Kow图像，并进行线性回归，得到结果如图3所示。
图3得到方程为logKow=7.521×logt+1.06651，R2=0.89608。不难看出双酚类有机物完全满足Kow与保留时间t之间的对数线性关系，能够很好说明当有机物Kow加大时，其HPLC保留时间t延长的基本规律，而这一规律很好的反映了色谱分离原理在HPLC的实现机制，即有机物在流动相与固定相中不断分配，达到平衡。而这个LC的分配原理与Kow的分配原理是一致的。在LC中固定相是C18，相当于Kow中作为有机相的正辛醇；而流动相是甲醇-水混合液，相当于是Kow中的水相。
（三）思考与讨论
由图3可知，实验结果举例中回归方程相关系数R2=0.89608，明显大于临界相关系数（R2=0.764，a< 0.01，n=7），说明具有显著相关性。但是相对而言，BPA和BPC的数据相关性最差。这可能是由于下列原因引起的：（1）实验由本组所有成员分别进样，可能是由实验中实验者的操作习惯或操作失误所造成的；（2）液相色谱的手动进样器松动，在换新的进样器前所得到的数据可能并不准确；（3）由于实验中BPA等物质的浓度没有控制，浓度过高的有机物对色谱峰展宽，给其保留时间t测定带来较大误差。
五、结论
通过近年的教学实践，该实验教学方案取得了良好效果，既帮助学习者生动快速地理解掌握HPLC的分离原理与实现方式，又让他们能够延伸知识点，掌握分配的重要基础和参数，以及判断有机物的保留时间，利用MSDS数据和操作Chemoffice软件等本领。另外，本设计对仪器条件要求较低，有利于在此基础上进行实验的扩展，既适于化学专业作为色谱实验系列教学内容的基础环节，又适于非化学专业（尤其是生物、环境、食品科学专业）将其作为基本实验教学内容加以应用。
[ 参 考 文 献 ]
[1] http：//chemwiki.ucdavis.edu / Wikitexts / UC_Davis / UCD_
Chem_115_Lab_Manual / Lab_2%3A_High_Performance_
Liquid_Chromatography.
[2] 邓南圣，吴峰.环境化学教程（第二版）[M].武汉：武汉大学出版社，2006.
[3] USEPA.Standard Test Method for Partition Coefficient（N-Octanol / Water） Estimation by Liquid Chromatography.E1147-92，1997.
[责任编辑：罗 艳]
[关键词]高压液相色谱（HPLC） 正辛醇-水分配系数（Kow） 相关性分析 实验设计
[中图分类号] G642.423 [文献标识码] A [文章编号] 2095-3437（2014）17-0160-03
液相色谱分析是仪器分析的重要手段之一，在现代有机物分析中发挥了巨大的作用。液相色谱分析教学也成为大学化学、生物、药学、环境科学、食品科学等诸多专业的《仪器分析》课程中的重要内容。随着我国经济的发展，各普通高校相关专业的实验条件得到改善，在《仪器分析》配套实验课程中逐步开设了高压液相色谱（HPLC）实验，有的甚至在专门的《色谱》课程配套实验中分不同类型、目的多方案开设实验。传统的HPLC教学实验常常选择一种到三种有机物作为对象，在一定色谱条件下进行色谱分离与定性定量检测，评估分离与分析的性能。然而，多年的教学经验让我们发现一个问题，学习过的学生甚至高年级的研究生并不能初步判断不同有机物在反相HPLC上的保留特性的差异，而且往往对色谱分离原理在HPLC的实现机制缺少应有的基本认知。这促使我们设计了一套新的液相色谱实验教学，即双酚类有机物的Kow测定。
一、实验原理
色谱法是一种借助色谱分离原理而使混合物中各组分分离的技术，它是混合物非常有效的分离、分析方法。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。图1给出了HPLC的基本组成与结构。
①流动相储液瓶；②溶剂脱气机；③梯度阀；④混合器；⑤高压泵；⑥六通阀；⑦定量环；⑧保护住；⑨色谱柱；⑩紫外检测器；{11}数据采集系统；{12}废液收集瓶。[1]
待测有机组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K表示，即：
分配系数是色谱分离的依据。常用的分配系数是正辛醇-水分配系数Kow，即：
式中：CO、CW分别为有机物在正辛醇相和水相中的平衡浓度。Kow不同，保留时间亦不同。现已积累了大量有机化合物的Kow值，是量化表征有机化合物疏水性的方法之一。[2]
USEPA根据Kow与色谱保留时间t的对数线性相关性[如方程（3）所示]，建立了基于反相HPLC保留时间t测定有机物Kow的标准方法。[3]
log Kow= a log t + b （3）
该标准方法中高效液相色谱法采用C-18反相色谱柱，流动相为甲醇-水混合液。本实验采用高效液相色谱法测定双酚类一系列结构相似的有机化合物的保留时间，通过考察保留时间与Kow之间的关系来进一步理解色谱法的原理，掌握基本实验操作和数据分析方法。本实验设计中选择的系列有机物是双酚类有机物，包括七种，其结构与名称如图2所示。
二、实验试剂及仪器
双酚类有机物BPA、TDP、BPAP、BPCH、BPP、TMBPA、BPC的稀溶液；高效液相色谱仪：安捷伦1200（低压四元梯度HPLC系统的组成见图1），压力：200kg / cm2；流速：1.0mL / min；二极管阵列紫外检测器；色谱柱：Kromasil 100-5C18，150×4.6mm。流动相甲醇-水混合液（80%甲醇∶20%水），20微升定量环。也可采用手动进样模式的HPLC。
三、实验步骤
1.按体积比配制80%的甲醇溶液，超声20min除去溶液中溶解的气体，用微孔滤膜过滤后即可作为流动相使用。
2.打开高效液相色谱仪，设置仪器参数：流速=1mL / min；检测波长λ=280nm；在工作站中设置样品的相关参数：样品名称、检测时间、文件指定的保存目录等。参数设好以后开泵脱气（每次更换新的流动相都要进行脱气操作），脱气完毕后测试基线。
3.待基线平稳以后，将配好的BPA等一系列双酚类有机物的稀溶液用进样针从进样口依次进样，设定每一次的检测时间为10min，记录各样品的出峰时间t，单位min。
4.样品测定完后，关闭紫外检测器。用超纯水进样，清洗进样器中残留的样品，用100%甲醇流动相冲洗色谱柱约30min，关闭高压泵。
四、实验结果及数据处理
（一）实验结果记录
在表1中记录七种双酚类有机物在HPLC上的保留时间t，同时查阅现有的化学物质安全手册（MSDS）或其他工具书，或者利用Chemiffice软件获得这些双酚类有机物的Kow，计算其对数，列于表1。
注：t为用液谱法测得的相应物质的保留时间；Kow由Chemoffice软件获得。
（二）确定log t与log Kow的关系
利用Origin软件（或者其他科学数据处理软件）作log t-log Kow图像，并进行线性回归，得到结果如图3所示。
图3得到方程为logKow=7.521×logt+1.06651，R2=0.89608。不难看出双酚类有机物完全满足Kow与保留时间t之间的对数线性关系，能够很好说明当有机物Kow加大时，其HPLC保留时间t延长的基本规律，而这一规律很好的反映了色谱分离原理在HPLC的实现机制，即有机物在流动相与固定相中不断分配，达到平衡。而这个LC的分配原理与Kow的分配原理是一致的。在LC中固定相是C18，相当于Kow中作为有机相的正辛醇；而流动相是甲醇-水混合液，相当于是Kow中的水相。
（三）思考与讨论
由图3可知，实验结果举例中回归方程相关系数R2=0.89608，明显大于临界相关系数（R2=0.764，a< 0.01，n=7），说明具有显著相关性。但是相对而言，BPA和BPC的数据相关性最差。这可能是由于下列原因引起的：（1）实验由本组所有成员分别进样，可能是由实验中实验者的操作习惯或操作失误所造成的；（2）液相色谱的手动进样器松动，在换新的进样器前所得到的数据可能并不准确；（3）由于实验中BPA等物质的浓度没有控制，浓度过高的有机物对色谱峰展宽，给其保留时间t测定带来较大误差。
五、结论
通过近年的教学实践，该实验教学方案取得了良好效果，既帮助学习者生动快速地理解掌握HPLC的分离原理与实现方式，又让他们能够延伸知识点，掌握分配的重要基础和参数，以及判断有机物的保留时间，利用MSDS数据和操作Chemoffice软件等本领。另外，本设计对仪器条件要求较低，有利于在此基础上进行实验的扩展，既适于化学专业作为色谱实验系列教学内容的基础环节，又适于非化学专业（尤其是生物、环境、食品科学专业）将其作为基本实验教学内容加以应用。
[ 参 考 文 献 ]
[1] http：//chemwiki.ucdavis.edu / Wikitexts / UC_Davis / UCD_
Chem_115_Lab_Manual / Lab_2%3A_High_Performance_
Liquid_Chromatography.
[2] 邓南圣，吴峰.环境化学教程（第二版）[M].武汉：武汉大学出版社，2006.
[3] USEPA.Standard Test Method for Partition Coefficient（N-Octanol / Water） Estimation by Liquid Chromatography.E1147-92，1997.
[责任编辑：罗 艳]