【摘 要】
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目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外定向分化为骨骼肌细胞的干预条件.方法 取健康4周龄Wistar大鼠MSCs制成细胞悬液接种于培养瓶中,置于37C
【机 构】
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山东省立医院创伤骨科,聊城市人民医院骨科,青岛市立医院骨科,四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室·干细胞与组织工程研究室
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目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外定向分化为骨骼肌细胞的干预条件.方法 取健康4周龄Wistar大鼠MSCs制成细胞悬液接种于培养瓶中,置于37C、5%CO2恒温培养箱中培养,倒置相差显微镜下观察,细胞布满瓶底即为1代,取第3代MSCs,以5-氮杂胞苷10 μmol/L、成肌分化因子0.1 ng/ml、转化生长因子β1 0.1 ng/ml、胰岛素样生长因子12 ng/ml进行联合诱导,使之分化.诱导后第9天,收集细胞,行MTT比色法、流式细胞仪和免疫组织化学检测鉴定细胞.结果 原代培养的MSCs呈贴壁生长,3～5 d呈集落样生长,5～7 d后有体积不等的多突成纤维细胞、较大的扁平多角形细胞、中等的多角形细胞和较小的三角形细胞.培养12 d后,细胞融合,铺满瓶底,MSCs形态变化不明显.联合诱导后,部分细胞死亡,生长缓慢;7 d后见细胞明显增殖,体积逐渐增大,呈椭圆形、梭形或不规则形状;14 d后,大量增殖的长梭形细胞开始增多;18～22 d后,肌管数量增多,体积增大,核数亦明显增多,初生肌管与长梭形成肌细胞呈平行排列,间隔分布.MSCs免疫组织化学法测定CD44反应阳性,胞质呈棕褐颗粒,核周明显,CD34呈阴性反应;诱导后MSCs结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为阳性表达.流式细胞仪测定MSCs和诱导后MSCs大部分处于G0/G1期,分别占79.4%、62.9%,而G2/S/M期仅占20.6%、36.1%.根据MTT绘制生长曲线,可见MSCs生长速度明显高于诱导后的MSCs.两种细胞并未达到平台期,都有继续增殖的趋势.结论 在体外,MyoD、5-氮杂胞苷可以诱导MSCs向骨骼肌细胞定向分化,并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达;定向诱导后MSCs增殖期比例大,向骨骼肌细胞分化纯度更高.
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