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[摘要] 目的 研究严重烧伤脓毒症患者骨骼肌蛋白降解变化及机制。 方法 2012年1～6月收集严重烧伤伴脓毒症患者8例为脓毒症组。同时选择整形患者10例作为对照。检测对照组及脓毒症组伤后3、5、7、14、21 d血清中肿瘤坏死因子-α、皮质醇、尿液中3-甲基组氨酸的含量，以及股四头肌中泛素基因表达和蛋白表达。 结果 脓毒症组烧伤后3、5、7、14、21 d各指标均显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。脓毒症组皮质醇、TNF-α、3-MH在烧伤后逐渐升高，7 d时达到高峰，后逐渐下降，但在21 d时仍然高于对照组。尿内3-MH的排泄量与血TNF-α和皮质素水平的变化呈正相关，r = 0.89、0.91，P < 0.01。脓毒症组股四头肌组织内泛素mRNA、E2-14k mRNA、C2亚基的mRNA、蛋白酶体C2亚基蛋白的表达较对照组均显著增加。 结论 严重烧伤脓毒症患者出现骨骼肌降解，与皮质醇、TNF-α升高有一定的关系。
[关键词] 烧伤；脓毒症；骨骼肌；蛋白
[中图分类号] R644 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）13-0018-03
脓毒症是重症烧伤常见而严重的并发症之一，常常发病急，进展快，并发器官功能衰竭，如果治疗不及时，患者病死率较高[1]。因此，严重烧伤脓毒症的救治一直是国内外烧伤医学界研究的热点、重点和亟待解决的重大疑难问题。烧伤脓毒症时患者骨骼肌蛋白出现高分解代谢，导致负担平衡[2]。目前关于烧伤脓毒症时骨胳肌蛋白高分解代谢的机制尚不完全明了。在脓毒症时，蛋白高分解代谢呈现“强制性”的特点，导致蛋白分解、糖和脂肪的利用率下降，机体负担平衡，营养不良，最终导致多种并发症的发生。骨骼肌约占机体细胞总量的50%，在蛋白分解代谢、负氮平衡中有重要的意义。本文的目的是探讨烧伤脓毒症患者骨骼肌蛋白降解变化及机制，为临床上预防和控制蛋白的高代谢提供理论依据。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2012年1～6月在我院进行治疗的严重烧伤伴脓毒症患者8例为脓毒症组，其中男6例，女2例，年龄18～47岁，平均（38.1±13.2）岁。平均烧伤面积（68.3±17.5）%，平均Ⅲ度烧伤面积达（46.8±14.9）%。所有患者均符合烧伤脓毒症的诊断标准[3]。选择同期住院行整形手术的患者10例为对照组，其中男7例，女3例，年龄23～45岁，平均（36.2±14.8）岁。两组性别比、年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），有可比性。所有入组患者均知情同意。
1.2 标本采集
收集对照组和脓毒症组伤后3 d、5 d、7 d、14 d、21 d的静脉血标本及24 h的尿标本。所有烧伤患者在切烧伤痂时顺肌纤维方向切取肱二头肌和股四头肌标本，对照组在整形瘢痕切除术时切取股四头肌标本。所有标本分为两部分，一部分采用甲醛固定，一部分置液氮保存。
1.3 检测方法
1.3.1 血标本 采集的静脉血标本静置分层，离心，取上清液进行检测。血浆皮质醇和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）采用化学发光免疫分析法进行检测，试剂盒由上海抚生实业有限公司提供。
1.3.2 尿标本 采用高效液相色谱-荧光检测法测定尿中3-甲基组氨酸。试剂由美国Sigma公司提供。
1.3.3 骨骼肌 ①泛素系统基因表达：一步法提取组织中的总的RNA，逆转录聚合酶联反应进行扩增，引物由赛百盛生物工程技术公司提供。每份RNA中去30 μg进行变性、电泳及转膜，在膜上标记28S rRNA条带和18S rRNA条带。然后将膜放入预杂交液，65℃，共5 h。将cDNA探针加入杂交A液内变性处理，冷却后加入杂交B液中，65℃预热。弃预杂交液，在加入杂交液，过夜。室温洗膜，然后60℃洗膜15 min，2遍。滤纸吸干，-65℃放置24 h，自显影。②泛素蛋白表达：骨骼肌组织石蜡包埋、切片，层厚4 μm，化腊、脱蜡。蒸馏水冲洗，浸泡于过氧化物中，取出过氧化物酶。PBS缓冲液冲洗3次，枸橼酸盐缓冲液中95℃，10 min，进行热修复。分别采用正漏水和PBS液清洗，封闭5 min，加兔抗鼠泛素抗体，37℃ 2 h，PBS液清洗3次，加辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，37℃作用1 h，PBS液冲洗3次，显色，甲基绿复染，乙醇脱水，封片，观察。
1.4 统计学处理
采用SPSS10.0统计学软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验，计量资料采用方差分析和t检验，3-甲基组氨酸与皮质醇和肿瘤坏死因子-α水平的关系采用Pearson相关性分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 皮质醇、TNF-α、3-甲基组氨酸结果
见表1和图1～3。脓毒症组烧伤后3、5、7、14、21 d各指标均显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。脓毒症组皮质醇、TNF-α、3-MH在烧伤后逐渐升高，在7 d时达到高峰，后逐渐下降，但在21 d时仍然高于对照组。
2.2 尿内3-MH的排泄量与血TNF-α和皮质素水平的相关性
尿内3-MH的排泄量与血TNF-α和皮质素水平的变化呈正相关，r = 0.89、0.91，P < 0.01。
2.3 泛素基因表达和蛋白的表达
脓毒症组股四头肌组织内泛素mRNA的表达2.4 kb和1.2 kb的表达较对照组均显著增加。见图4。脓毒症患者E2-14k mRNA的表达显著强于对照组。见图5。脓毒症组C2亚基的mRNA表达明显强于对照组。见图6。蛋白酶体C2亚基蛋白的表达见图7，脓毒症组显著强于对照组。
3 讨论
脓毒症是严重烧伤患者的常见并发症，患者往往起病急、进展快，严重者可导致多器官功能障碍，甚至危及生命[4]。患者主要表现为精神兴奋、多语、谵妄等异常，体温骤升至39.5℃以上或剧降至正常以下，呼吸>35次/min，心率>140次/min，腹胀、肠鸣音减弱或消失，创面急剧恶化，出现脓毒性休克时出现少尿。1905年Sneve提出严重烧伤患者存在高代谢情况，表现为明显的疲乏、虚弱、消瘦。在烧伤早期，骨骼肌处于高分解代谢状态，这种分解代谢有利于机体的自我保护，为肝脏合成急性期蛋白提供游离氨基酸，为免疫系统及肠上皮细胞提供谷氨酸。但大量肌纤维蛋白的分解，造成负氮平衡，长期下去导致患者抵抗力下降，影响预后[5]。 泛素（ubiquitin）是一种存在于大多数真核细胞中的小蛋白。它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，使其被水解[6]。当附有泛素的蛋白质移动到桶状的蛋白酶的时候，蛋白酶就会将该蛋白质水解。泛素相关酶催化的一系列反应发生的整个过程被称为泛素化信号通路。泛素蛋白降解的途径在骨骼肌代谢中具有重要的意义。泛素化系统主要有三部分，包括蛋白酶体、泛素、泛素相关酶。泛素相关酶包括泛素活化酶、泛素偶联酶、泛素连接酶、泛素链延长酶及去泛素化酶[7]。其中E2-14k酶与骨骼肌的分解代谢具有密切的关系。C2亚基是蛋白降解的中心结构。本研究显示，脓毒症患者泛素 mRNA、E2-14k、C2亚基mRNA的表达均显著高于对照组，说明脓毒症患者存在明显的骨骼肌分解代谢。
3-甲基组氨酸是1-甲基组氨酸的同分异构体，是肌动蛋白的一个组分。1967年Johnson等发现肌动蛋白和肌球蛋白中均含有3-MH，蛋白结合状态的3-MH主要分布在骨骼肌内。3-MH主要通过尿路排泄。当肌肉分解代谢时，3-MH同其他氨基酸一起释放入血，然后经过尿排出。因此测定尿液中3-MH的含量是肌肉蛋白质分解代谢的可靠指标。本研究结果也显示，脓毒症组尿3-MH显著高于对照组，且在烧伤后7 d达到峰值，随后逐渐下降。
TNF-α是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一，属于炎症因子，在机体处于感染的情况下，TNF-α分泌增加。皮质醇是由肾上腺皮质分泌的一类甾体激素，具有调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢的作用，还具有抗炎作用，当机体处于应激状态时，皮质醇分泌明显增多。本文显示，脓毒症患者血中TNF-α和皮质醇水平均显著升高，且在7 d时达到高峰。而皮质醇和TNF水平的增加能够激活泛素蛋白酶体途径[8]，促进骨骼肌的代谢。尿内3-MH的排泄量与血TNF-α和皮质素水平的变化呈正相关，也印证了皮质醇和泛素能够促进骨骼肌分解代谢。
综上所述，烧伤脓毒症患者存在明显的骨骼肌分解代谢，其发生与脓毒症患者血中TNF-α和皮质醇水平升高有一定的关系。
[参考文献]
[1] 刘金凤. 烧伤后脓毒症[J]. 淮海医药，2008，26（2）：186-188.
[2] 柴家科，盛志勇. 应重视严重烧伤脓毒症患者骨骼肌蛋白高分解代谢的研究[J]. 中华医学杂志，2005，85（41）：2883-2885.
[3] Chai K，Sheng ZY，Gao JC，et al. The characteristics and prognosis of 111 burn patients with sepsis[J]. Chinese Crit Care Med，1999，11：721-724.
[4] 张立明，王润秀，蒙诚跃，等. 烧伤脓毒症患者治疗前后中性粒细胞表面分子CD64与C-反应蛋白的变化和意义[J]. 广西医科大学学报，2011，28（6）：855-857.
[5] 蔺静. 脓毒症大鼠骨骼肌蛋白高分解代谢的蛋白质组研究[D]. 中国人民解放军军医进修学院，2008：7.
[6] 朱荣. 泛素蛋白酶体途径在运动骨骼肌领域的研究进展[J]. 北京体育大学学报，2012，9：85-91.
[7] 陈科，程汉华，周荣家. 自噬与泛素化蛋白降解途径的分子机制及其功能[J]. 遗传，2012，34（1）：5-18.
[8] 申传安，柴家科. 肿瘤坏死因子在烧伤脓毒症大鼠骨骼肌蛋白高分解代谢中的作用及其机制[J]. 中国危重病急救医学，2002，14（6）：340-343.
（收稿日期：2013-01-25）
[关键词] 烧伤；脓毒症；骨骼肌；蛋白
[中图分类号] R644 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）13-0018-03
脓毒症是重症烧伤常见而严重的并发症之一，常常发病急，进展快，并发器官功能衰竭，如果治疗不及时，患者病死率较高[1]。因此，严重烧伤脓毒症的救治一直是国内外烧伤医学界研究的热点、重点和亟待解决的重大疑难问题。烧伤脓毒症时患者骨骼肌蛋白出现高分解代谢，导致负担平衡[2]。目前关于烧伤脓毒症时骨胳肌蛋白高分解代谢的机制尚不完全明了。在脓毒症时，蛋白高分解代谢呈现“强制性”的特点，导致蛋白分解、糖和脂肪的利用率下降，机体负担平衡，营养不良，最终导致多种并发症的发生。骨骼肌约占机体细胞总量的50%，在蛋白分解代谢、负氮平衡中有重要的意义。本文的目的是探讨烧伤脓毒症患者骨骼肌蛋白降解变化及机制，为临床上预防和控制蛋白的高代谢提供理论依据。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2012年1～6月在我院进行治疗的严重烧伤伴脓毒症患者8例为脓毒症组，其中男6例，女2例，年龄18～47岁，平均（38.1±13.2）岁。平均烧伤面积（68.3±17.5）%，平均Ⅲ度烧伤面积达（46.8±14.9）%。所有患者均符合烧伤脓毒症的诊断标准[3]。选择同期住院行整形手术的患者10例为对照组，其中男7例，女3例，年龄23～45岁，平均（36.2±14.8）岁。两组性别比、年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），有可比性。所有入组患者均知情同意。
1.2 标本采集
收集对照组和脓毒症组伤后3 d、5 d、7 d、14 d、21 d的静脉血标本及24 h的尿标本。所有烧伤患者在切烧伤痂时顺肌纤维方向切取肱二头肌和股四头肌标本，对照组在整形瘢痕切除术时切取股四头肌标本。所有标本分为两部分，一部分采用甲醛固定，一部分置液氮保存。
1.3 检测方法
1.3.1 血标本 采集的静脉血标本静置分层，离心，取上清液进行检测。血浆皮质醇和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）采用化学发光免疫分析法进行检测，试剂盒由上海抚生实业有限公司提供。
1.3.2 尿标本 采用高效液相色谱-荧光检测法测定尿中3-甲基组氨酸。试剂由美国Sigma公司提供。
1.3.3 骨骼肌 ①泛素系统基因表达：一步法提取组织中的总的RNA，逆转录聚合酶联反应进行扩增，引物由赛百盛生物工程技术公司提供。每份RNA中去30 μg进行变性、电泳及转膜，在膜上标记28S rRNA条带和18S rRNA条带。然后将膜放入预杂交液，65℃，共5 h。将cDNA探针加入杂交A液内变性处理，冷却后加入杂交B液中，65℃预热。弃预杂交液，在加入杂交液，过夜。室温洗膜，然后60℃洗膜15 min，2遍。滤纸吸干，-65℃放置24 h，自显影。②泛素蛋白表达：骨骼肌组织石蜡包埋、切片，层厚4 μm，化腊、脱蜡。蒸馏水冲洗，浸泡于过氧化物中，取出过氧化物酶。PBS缓冲液冲洗3次，枸橼酸盐缓冲液中95℃，10 min，进行热修复。分别采用正漏水和PBS液清洗，封闭5 min，加兔抗鼠泛素抗体，37℃ 2 h，PBS液清洗3次，加辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，37℃作用1 h，PBS液冲洗3次，显色，甲基绿复染，乙醇脱水，封片，观察。
1.4 统计学处理
采用SPSS10.0统计学软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验，计量资料采用方差分析和t检验，3-甲基组氨酸与皮质醇和肿瘤坏死因子-α水平的关系采用Pearson相关性分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 皮质醇、TNF-α、3-甲基组氨酸结果
见表1和图1～3。脓毒症组烧伤后3、5、7、14、21 d各指标均显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。脓毒症组皮质醇、TNF-α、3-MH在烧伤后逐渐升高，在7 d时达到高峰，后逐渐下降，但在21 d时仍然高于对照组。
2.2 尿内3-MH的排泄量与血TNF-α和皮质素水平的相关性
尿内3-MH的排泄量与血TNF-α和皮质素水平的变化呈正相关，r = 0.89、0.91，P < 0.01。
2.3 泛素基因表达和蛋白的表达
脓毒症组股四头肌组织内泛素mRNA的表达2.4 kb和1.2 kb的表达较对照组均显著增加。见图4。脓毒症患者E2-14k mRNA的表达显著强于对照组。见图5。脓毒症组C2亚基的mRNA表达明显强于对照组。见图6。蛋白酶体C2亚基蛋白的表达见图7，脓毒症组显著强于对照组。
3 讨论
脓毒症是严重烧伤患者的常见并发症，患者往往起病急、进展快，严重者可导致多器官功能障碍，甚至危及生命[4]。患者主要表现为精神兴奋、多语、谵妄等异常，体温骤升至39.5℃以上或剧降至正常以下，呼吸>35次/min，心率>140次/min，腹胀、肠鸣音减弱或消失，创面急剧恶化，出现脓毒性休克时出现少尿。1905年Sneve提出严重烧伤患者存在高代谢情况，表现为明显的疲乏、虚弱、消瘦。在烧伤早期，骨骼肌处于高分解代谢状态，这种分解代谢有利于机体的自我保护，为肝脏合成急性期蛋白提供游离氨基酸，为免疫系统及肠上皮细胞提供谷氨酸。但大量肌纤维蛋白的分解，造成负氮平衡，长期下去导致患者抵抗力下降，影响预后[5]。 泛素（ubiquitin）是一种存在于大多数真核细胞中的小蛋白。它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，使其被水解[6]。当附有泛素的蛋白质移动到桶状的蛋白酶的时候，蛋白酶就会将该蛋白质水解。泛素相关酶催化的一系列反应发生的整个过程被称为泛素化信号通路。泛素蛋白降解的途径在骨骼肌代谢中具有重要的意义。泛素化系统主要有三部分，包括蛋白酶体、泛素、泛素相关酶。泛素相关酶包括泛素活化酶、泛素偶联酶、泛素连接酶、泛素链延长酶及去泛素化酶[7]。其中E2-14k酶与骨骼肌的分解代谢具有密切的关系。C2亚基是蛋白降解的中心结构。本研究显示，脓毒症患者泛素 mRNA、E2-14k、C2亚基mRNA的表达均显著高于对照组，说明脓毒症患者存在明显的骨骼肌分解代谢。
3-甲基组氨酸是1-甲基组氨酸的同分异构体，是肌动蛋白的一个组分。1967年Johnson等发现肌动蛋白和肌球蛋白中均含有3-MH，蛋白结合状态的3-MH主要分布在骨骼肌内。3-MH主要通过尿路排泄。当肌肉分解代谢时，3-MH同其他氨基酸一起释放入血，然后经过尿排出。因此测定尿液中3-MH的含量是肌肉蛋白质分解代谢的可靠指标。本研究结果也显示，脓毒症组尿3-MH显著高于对照组，且在烧伤后7 d达到峰值，随后逐渐下降。
TNF-α是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一，属于炎症因子，在机体处于感染的情况下，TNF-α分泌增加。皮质醇是由肾上腺皮质分泌的一类甾体激素，具有调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢的作用，还具有抗炎作用，当机体处于应激状态时，皮质醇分泌明显增多。本文显示，脓毒症患者血中TNF-α和皮质醇水平均显著升高，且在7 d时达到高峰。而皮质醇和TNF水平的增加能够激活泛素蛋白酶体途径[8]，促进骨骼肌的代谢。尿内3-MH的排泄量与血TNF-α和皮质素水平的变化呈正相关，也印证了皮质醇和泛素能够促进骨骼肌分解代谢。
综上所述，烧伤脓毒症患者存在明显的骨骼肌分解代谢，其发生与脓毒症患者血中TNF-α和皮质醇水平升高有一定的关系。
[参考文献]
[1] 刘金凤. 烧伤后脓毒症[J]. 淮海医药，2008，26（2）：186-188.
[2] 柴家科，盛志勇. 应重视严重烧伤脓毒症患者骨骼肌蛋白高分解代谢的研究[J]. 中华医学杂志，2005，85（41）：2883-2885.
[3] Chai K，Sheng ZY，Gao JC，et al. The characteristics and prognosis of 111 burn patients with sepsis[J]. Chinese Crit Care Med，1999，11：721-724.
[4] 张立明，王润秀，蒙诚跃，等. 烧伤脓毒症患者治疗前后中性粒细胞表面分子CD64与C-反应蛋白的变化和意义[J]. 广西医科大学学报，2011，28（6）：855-857.
[5] 蔺静. 脓毒症大鼠骨骼肌蛋白高分解代谢的蛋白质组研究[D]. 中国人民解放军军医进修学院，2008：7.
[6] 朱荣. 泛素蛋白酶体途径在运动骨骼肌领域的研究进展[J]. 北京体育大学学报，2012，9：85-91.
[7] 陈科，程汉华，周荣家. 自噬与泛素化蛋白降解途径的分子机制及其功能[J]. 遗传，2012，34（1）：5-18.
[8] 申传安，柴家科. 肿瘤坏死因子在烧伤脓毒症大鼠骨骼肌蛋白高分解代谢中的作用及其机制[J]. 中国危重病急救医学，2002，14（6）：340-343.
（收稿日期：2013-01-25）