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[摘要] 目的 探讨Rho激酶抑制剂法舒地尔对糖尿病肾病大鼠蛋白尿的影响。 方法 把30只SD雄性大鼠随机分为对照组（n = 10）、糖尿病肾病组（n = 10）、法舒地尔治疗组（n = 10）。STZ腹腔注射造模成功后，法舒地尔治疗组给予法舒地尔10 mg/（kg·d）腹腔注射，对照组及糖尿病肾病组给予等量的生理盐水腹腔注射，每天2次，连续12周。检测三组大鼠24 h尿蛋白定量，取大鼠心脏血测定尿素氮（BUN）、肌酐（ Scr）。 结果 糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组24 h尿蛋白水平明显高于对照组（P均<0.01）。与糖尿病肾病组比较，法舒地尔治疗组24 h尿蛋白定量、血BUN、Scr明显下降（P < 0.01）。 结论 法舒地尔能在一定程度上减少糖尿病肾病大鼠的蛋白尿、减轻肾功能的损害。
[关键词] 法舒地尔；糖尿病肾病；蛋白尿
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）13-0155-02
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要并发症之一，是以微血管病变为主的肾实质病变，是糖尿病患者重要的死亡原因。临床上，DN早期表现为肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）升高，随后出现微量白蛋白尿，一旦出现显性蛋白尿，病情则不断进展，最后进入肾衰竭期，即尿毒症期。蛋白尿是糖尿病肾病发生、发展中的重要因素[1]。因此，减轻蛋白尿可延缓或阻止DN的发生和进展。近年来，研究发现Rho激酶抑制剂可作用于多种细胞，通过抑制Rho/ROCK信号通路，改善肾脏血流动力学，抑制氧化应激、细胞因子及炎症因子，减轻蛋白尿，从而延缓糖尿病肾病的发生、发展[2]。本研究旨在观察Rho激酶抑制剂法舒地尔对糖尿病肾病大鼠蛋白尿的影响，了解其在糖尿病肾病中的有益作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选取Sprague-Dawely雄性大鼠30只（SPF级，湖北省实验动物中心提供），体重约200～250 g。盐酸法舒地尔注射液 （商品名：川威，天津红日药业股份有限公司生产）。
1.2 建立动物模型
将30只大鼠常规喂养1周，测定血糖正常后随机分为三组：Ⅰ组：对照组10只；Ⅱ组：糖尿病肾病组10只，Ⅲ组：法舒地尔治疗组10只。糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后连续3 d测定尾血随机血糖≥16.7 mmol/L为成功模型。建模成功后，对照组及糖尿病肾病组每天给予等量的生理盐水腹腔注射，法舒地尔治疗组给予法舒地尔10 mg/（kg·d）腹腔注射，连续12周。对于建模成功的糖尿病肾病组和法舒地尔组大鼠不予胰岛素处理，三组动物饲养条件相同。均无动物意外死亡。
1.3 标本的收集
实验结束前1天，将大鼠置入代谢笼，收集24 h尿液，测定24 h尿蛋白水平；腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉大鼠，心尖部取血，离心分离血清后测定尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）水平。
1.4 统计学处理
实验所得数据均用SPSS13.0软件包处理，数据用均数±标准差（x±s）表示；采用方差分析进行多组资料的比较。以P < 0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 24 h尿蛋白结果
24 h尿蛋白水平糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组均明显高于对照组（P < 0.01），表明糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组的糖尿病肾病建模成功。见表1。
2.2 法舒地尔对糖尿病肾病大鼠24 h尿蛋白、血BUN、Scr的影响
与糖尿病肾病组比较，法舒地尔治疗组24 h尿蛋白、血Scr、BUN水平明显下降（P < 0.01）。
3 讨论
DN尿蛋白的发生机制很复杂，可能是肾脏血流动力学异常、肾小球滤过屏障受损、肾小管重吸收异常、多种生长因子如血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）及晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）等多个因素综合作用的结果[3]。糖代谢紊乱可引起血管紧张素Ⅱ（angiotension-Ⅱ，Ang-Ⅱ）、血管紧张素转化酶（angiotension converting enzyme，ACE）、内皮素（endothelin，ET）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、血管内皮细胞生长因子（vascular endotheliar growth factor，VEGF）等一系列血管活性因子活性增强，这些因素可使肾小球入球动脉扩张程度明显强于出球动脉，从而使肾小球出现高灌注、高滤过，促使血浆蛋白从肾小球滤过增加。另外，VEGF还能通过作用于内皮细胞上的受体，使其通透性增加，导致血浆蛋白滤过增加[4]。
Rho/Rho激酶（Rho/ROCK）是具有信息传导和分子开关功能的信号多肽[5]。它可以通过调节细胞内蛋白骨架的聚合状态对细胞形态、细胞粘附与迁移、细胞增殖与凋亡、平滑肌收缩等多种细胞功能进行调节。研究发现，激活的Rho/ROCK能上调激活蛋白（AP）-1、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGF-β）等，下调内皮型一氧化氮合酶（eNOS），从而增强Ca2 依赖的血管平滑肌收缩，促进平滑肌细胞的增殖，促进肾脏纤维化，从而导致肾脏血流动力学异常、肾小球滤过屏障受损、肾小管重吸收异常等，促进糖尿病肾病的发展[2]。法舒地尔（fasudil）是Rho/ROCK信号通路选择性抑制剂。Ishikawa等[6]研究表明，长期的法舒地尔治疗能够减少细胞外基质的产生，抑制单核-巨噬细胞的浸润和氧化应激，上调eNOS的表达，从而达到保护肾脏的作用。马东蔚等[7]研究发现法舒地尔通过抑制高糖培养的人肾小球系膜细胞的Rho/ROCK信号转导通路，从而降低下游的炎症因子和细胞因子的分泌，减少炎症反应及纤维化，延缓糖尿病肾病的进展。 本研究结果显示，给予法舒地尔治疗12周后，法舒地尔治疗组24 h尿蛋白水平、血BUN、Scr水平明显均低于糖尿病肾病组，具有显著性差异（P < 0.01），提示法舒地尔能减少糖尿病肾病大鼠蛋白尿，改善肾脏功能，具有肾脏保护作用。其机制与法舒地尔通过抑制Rho/ROCK信号通路，改善肾脏血流动力学，抑制氧化应激、细胞因子及炎症因子，抑制肾纤维化，减轻蛋白尿有关。
总之，Rho/ROCK在糖尿病肾病的发生、发展中有着重要的作用。本研究显示法舒地尔对糖尿病肾病具有保护作用，抑制Rho/ROCK可能为治疗糖尿病肾病提供一种新的治疗策略。但是，此过程亦决定于包括上述因素在内、还有其他多种因素之间的共同作用和平衡，法舒地尔对糖尿病肾病保护作用的具体机制，还应进一步研究。
[参考文献]
[1] Dronavalli S，Duka I，Bakris GL. The pathogenesis of diabetic nephropa thy[J]. J Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2008，4（8）：444-452.
[2] Hayashi K，Wakino S，Kanda T，et al. Molecular mechanisms and therapeutic strategies of chronic renal injury：role of rho-kinase in the development of renal injury[J]. J Pharmacol Sci，2006，100（1）：29-33.
[3] Wolf G，Ziyadeh FN. Cellular and molecular mechanisms of proteinuria in diabetic nephropathy[J]. Nephron Physiol，2007，106（2）：26-31.
[4] Doi K，Eoiri E，Fujita T. Role of vascular endothelial growth factor in kidney disease[J]. Curr Vasc Pharmacol，2010，8（1）：122-129.
[5] Liao JK，Seto M，Noma K. Rho kinase （ROCK） inhibitors[J]. J Cardiovasc Pharmacol，2007，50（1）：17-24.
[6] Ishikawa Y，Nishikimi T，Akimoto K，et al. Long-term administration of Rho-kinase inhibitor ameliorates renal damage in malignant hyper tensive rats[J]. Hypertension，2006，47：1075-1083.
[7] 马东蔚，王秋月，马小羽，等. 法舒地尔通过Rho-ROCK信号通路对高糖培养人肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化影响[J]. 中华内科杂志，2011，7（50）：580-584.
（收稿日期：2013-02-21）
[关键词] 法舒地尔；糖尿病肾病；蛋白尿
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）13-0155-02
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要并发症之一，是以微血管病变为主的肾实质病变，是糖尿病患者重要的死亡原因。临床上，DN早期表现为肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）升高，随后出现微量白蛋白尿，一旦出现显性蛋白尿，病情则不断进展，最后进入肾衰竭期，即尿毒症期。蛋白尿是糖尿病肾病发生、发展中的重要因素[1]。因此，减轻蛋白尿可延缓或阻止DN的发生和进展。近年来，研究发现Rho激酶抑制剂可作用于多种细胞，通过抑制Rho/ROCK信号通路，改善肾脏血流动力学，抑制氧化应激、细胞因子及炎症因子，减轻蛋白尿，从而延缓糖尿病肾病的发生、发展[2]。本研究旨在观察Rho激酶抑制剂法舒地尔对糖尿病肾病大鼠蛋白尿的影响，了解其在糖尿病肾病中的有益作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选取Sprague-Dawely雄性大鼠30只（SPF级，湖北省实验动物中心提供），体重约200～250 g。盐酸法舒地尔注射液 （商品名：川威，天津红日药业股份有限公司生产）。
1.2 建立动物模型
将30只大鼠常规喂养1周，测定血糖正常后随机分为三组：Ⅰ组：对照组10只；Ⅱ组：糖尿病肾病组10只，Ⅲ组：法舒地尔治疗组10只。糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后连续3 d测定尾血随机血糖≥16.7 mmol/L为成功模型。建模成功后，对照组及糖尿病肾病组每天给予等量的生理盐水腹腔注射，法舒地尔治疗组给予法舒地尔10 mg/（kg·d）腹腔注射，连续12周。对于建模成功的糖尿病肾病组和法舒地尔组大鼠不予胰岛素处理，三组动物饲养条件相同。均无动物意外死亡。
1.3 标本的收集
实验结束前1天，将大鼠置入代谢笼，收集24 h尿液，测定24 h尿蛋白水平；腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉大鼠，心尖部取血，离心分离血清后测定尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）水平。
1.4 统计学处理
实验所得数据均用SPSS13.0软件包处理，数据用均数±标准差（x±s）表示；采用方差分析进行多组资料的比较。以P < 0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 24 h尿蛋白结果
24 h尿蛋白水平糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组均明显高于对照组（P < 0.01），表明糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组的糖尿病肾病建模成功。见表1。
2.2 法舒地尔对糖尿病肾病大鼠24 h尿蛋白、血BUN、Scr的影响
与糖尿病肾病组比较，法舒地尔治疗组24 h尿蛋白、血Scr、BUN水平明显下降（P < 0.01）。
3 讨论
DN尿蛋白的发生机制很复杂，可能是肾脏血流动力学异常、肾小球滤过屏障受损、肾小管重吸收异常、多种生长因子如血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）及晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）等多个因素综合作用的结果[3]。糖代谢紊乱可引起血管紧张素Ⅱ（angiotension-Ⅱ，Ang-Ⅱ）、血管紧张素转化酶（angiotension converting enzyme，ACE）、内皮素（endothelin，ET）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、血管内皮细胞生长因子（vascular endotheliar growth factor，VEGF）等一系列血管活性因子活性增强，这些因素可使肾小球入球动脉扩张程度明显强于出球动脉，从而使肾小球出现高灌注、高滤过，促使血浆蛋白从肾小球滤过增加。另外，VEGF还能通过作用于内皮细胞上的受体，使其通透性增加，导致血浆蛋白滤过增加[4]。
Rho/Rho激酶（Rho/ROCK）是具有信息传导和分子开关功能的信号多肽[5]。它可以通过调节细胞内蛋白骨架的聚合状态对细胞形态、细胞粘附与迁移、细胞增殖与凋亡、平滑肌收缩等多种细胞功能进行调节。研究发现，激活的Rho/ROCK能上调激活蛋白（AP）-1、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGF-β）等，下调内皮型一氧化氮合酶（eNOS），从而增强Ca2 依赖的血管平滑肌收缩，促进平滑肌细胞的增殖，促进肾脏纤维化，从而导致肾脏血流动力学异常、肾小球滤过屏障受损、肾小管重吸收异常等，促进糖尿病肾病的发展[2]。法舒地尔（fasudil）是Rho/ROCK信号通路选择性抑制剂。Ishikawa等[6]研究表明，长期的法舒地尔治疗能够减少细胞外基质的产生，抑制单核-巨噬细胞的浸润和氧化应激，上调eNOS的表达，从而达到保护肾脏的作用。马东蔚等[7]研究发现法舒地尔通过抑制高糖培养的人肾小球系膜细胞的Rho/ROCK信号转导通路，从而降低下游的炎症因子和细胞因子的分泌，减少炎症反应及纤维化，延缓糖尿病肾病的进展。 本研究结果显示，给予法舒地尔治疗12周后，法舒地尔治疗组24 h尿蛋白水平、血BUN、Scr水平明显均低于糖尿病肾病组，具有显著性差异（P < 0.01），提示法舒地尔能减少糖尿病肾病大鼠蛋白尿，改善肾脏功能，具有肾脏保护作用。其机制与法舒地尔通过抑制Rho/ROCK信号通路，改善肾脏血流动力学，抑制氧化应激、细胞因子及炎症因子，抑制肾纤维化，减轻蛋白尿有关。
总之，Rho/ROCK在糖尿病肾病的发生、发展中有着重要的作用。本研究显示法舒地尔对糖尿病肾病具有保护作用，抑制Rho/ROCK可能为治疗糖尿病肾病提供一种新的治疗策略。但是，此过程亦决定于包括上述因素在内、还有其他多种因素之间的共同作用和平衡，法舒地尔对糖尿病肾病保护作用的具体机制，还应进一步研究。
[参考文献]
[1] Dronavalli S，Duka I，Bakris GL. The pathogenesis of diabetic nephropa thy[J]. J Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2008，4（8）：444-452.
[2] Hayashi K，Wakino S，Kanda T，et al. Molecular mechanisms and therapeutic strategies of chronic renal injury：role of rho-kinase in the development of renal injury[J]. J Pharmacol Sci，2006，100（1）：29-33.
[3] Wolf G，Ziyadeh FN. Cellular and molecular mechanisms of proteinuria in diabetic nephropathy[J]. Nephron Physiol，2007，106（2）：26-31.
[4] Doi K，Eoiri E，Fujita T. Role of vascular endothelial growth factor in kidney disease[J]. Curr Vasc Pharmacol，2010，8（1）：122-129.
[5] Liao JK，Seto M，Noma K. Rho kinase （ROCK） inhibitors[J]. J Cardiovasc Pharmacol，2007，50（1）：17-24.
[6] Ishikawa Y，Nishikimi T，Akimoto K，et al. Long-term administration of Rho-kinase inhibitor ameliorates renal damage in malignant hyper tensive rats[J]. Hypertension，2006，47：1075-1083.
[7] 马东蔚，王秋月，马小羽，等. 法舒地尔通过Rho-ROCK信号通路对高糖培养人肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化影响[J]. 中华内科杂志，2011，7（50）：580-584.
（收稿日期：2013-02-21）