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[摘要] 目的 探讨Rho激酶抑制剂法舒地尔对糖尿病肾病大鼠蛋白尿的影响。 方法 把30只SD雄性大鼠随机分为对照组(n = 10)、糖尿病肾病组(n = 10)、法舒地尔治疗组(n = 10)。STZ腹腔注射造模成功后,法舒地尔治疗组给予法舒地尔10 mg/(kg·d)腹腔注射,对照组及糖尿病肾病组给予等量的生理盐水腹腔注射,每天2次,连续12周。检测三组大鼠24 h尿蛋白定量,取大鼠心脏血测定尿素氮(BUN)、肌酐( Scr)。 结果 糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组24 h尿蛋白水平明显高于对照组(P均<0.01)。与糖尿病肾病组比较,法舒地尔治疗组24 h尿蛋白定量、血BUN、Scr明显下降(P < 0.01)。 结论 法舒地尔能在一定程度上减少糖尿病肾病大鼠的蛋白尿、减轻肾功能的损害。
[关键词] 法舒地尔;糖尿病肾病;蛋白尿
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2013)13-0155-02
糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的主要并发症之一,是以微血管病变为主的肾实质病变,是糖尿病患者重要的死亡原因。临床上,DN早期表现为肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)升高,随后出现微量白蛋白尿,一旦出现显性蛋白尿,病情则不断进展,最后进入肾衰竭期,即尿毒症期。蛋白尿是糖尿病肾病发生、发展中的重要因素[1]。因此,减轻蛋白尿可延缓或阻止DN的发生和进展。近年来,研究发现Rho激酶抑制剂可作用于多种细胞,通过抑制Rho/ROCK信号通路,改善肾脏血流动力学,抑制氧化应激、细胞因子及炎症因子,减轻蛋白尿,从而延缓糖尿病肾病的发生、发展[2]。本研究旨在观察Rho激酶抑制剂法舒地尔对糖尿病肾病大鼠蛋白尿的影响,了解其在糖尿病肾病中的有益作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选取Sprague-Dawely雄性大鼠30只(SPF级,湖北省实验动物中心提供),体重约200~250 g。盐酸法舒地尔注射液 (商品名:川威,天津红日药业股份有限公司生产)。
1.2 建立动物模型
将30只大鼠常规喂养1周,测定血糖正常后随机分为三组:Ⅰ组:对照组10只;Ⅱ组:糖尿病肾病组10只,Ⅲ组:法舒地尔治疗组10只。糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组腹腔注射STZ 60 mg/kg,72 h后连续3 d测定尾血随机血糖≥16.7 mmol/L为成功模型。建模成功后,对照组及糖尿病肾病组每天给予等量的生理盐水腹腔注射,法舒地尔治疗组给予法舒地尔10 mg/(kg·d)腹腔注射,连续12周。对于建模成功的糖尿病肾病组和法舒地尔组大鼠不予胰岛素处理,三组动物饲养条件相同。均无动物意外死亡。
1.3 标本的收集
实验结束前1天,将大鼠置入代谢笼,收集24 h尿液,测定24 h尿蛋白水平;腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉大鼠,心尖部取血,离心分离血清后测定尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平。
1.4 统计学处理
实验所得数据均用SPSS13.0软件包处理,数据用均数±标准差(x±s)表示;采用方差分析进行多组资料的比较。以P < 0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 24 h尿蛋白结果
24 h尿蛋白水平糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组均明显高于对照组(P < 0.01),表明糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组的糖尿病肾病建模成功。见表1。
2.2 法舒地尔对糖尿病肾病大鼠24 h尿蛋白、血BUN、Scr的影响
与糖尿病肾病组比较,法舒地尔治疗组24 h尿蛋白、血Scr、BUN水平明显下降(P < 0.01)。
3 讨论
DN尿蛋白的发生机制很复杂,可能是肾脏血流动力学异常、肾小球滤过屏障受损、肾小管重吸收异常、多种生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)及晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)等多个因素综合作用的结果[3]。糖代谢紊乱可引起血管紧张素Ⅱ(angiotension-Ⅱ,Ang-Ⅱ)、血管紧张素转化酶(angiotension converting enzyme,ACE)、内皮素(endothelin,ET)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、血管内皮细胞生长因子(vascular endotheliar growth factor,VEGF)等一系列血管活性因子活性增强,这些因素可使肾小球入球动脉扩张程度明显强于出球动脉,从而使肾小球出现高灌注、高滤过,促使血浆蛋白从肾小球滤过增加。另外,VEGF还能通过作用于内皮细胞上的受体,使其通透性增加,导致血浆蛋白滤过增加[4]。
Rho/Rho激酶(Rho/ROCK)是具有信息传导和分子开关功能的信号多肽[5]。它可以通过调节细胞内蛋白骨架的聚合状态对细胞形态、细胞粘附与迁移、细胞增殖与凋亡、平滑肌收缩等多种细胞功能进行调节。研究发现,激活的Rho/ROCK能上调激活蛋白(AP)-1、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β)等,下调内皮型一氧化氮合酶(eNOS),从而增强Ca2 依赖的血管平滑肌收缩,促进平滑肌细胞的增殖,促进肾脏纤维化,从而导致肾脏血流动力学异常、肾小球滤过屏障受损、肾小管重吸收异常等,促进糖尿病肾病的发展[2]。法舒地尔(fasudil)是Rho/ROCK信号通路选择性抑制剂。Ishikawa等[6]研究表明,长期的法舒地尔治疗能够减少细胞外基质的产生,抑制单核-巨噬细胞的浸润和氧化应激,上调eNOS的表达,从而达到保护肾脏的作用。马东蔚等[7]研究发现法舒地尔通过抑制高糖培养的人肾小球系膜细胞的Rho/ROCK信号转导通路,从而降低下游的炎症因子和细胞因子的分泌,减少炎症反应及纤维化,延缓糖尿病肾病的进展。 本研究结果显示,给予法舒地尔治疗12周后,法舒地尔治疗组24 h尿蛋白水平、血BUN、Scr水平明显均低于糖尿病肾病组,具有显著性差异(P < 0.01),提示法舒地尔能减少糖尿病肾病大鼠蛋白尿,改善肾脏功能,具有肾脏保护作用。其机制与法舒地尔通过抑制Rho/ROCK信号通路,改善肾脏血流动力学,抑制氧化应激、细胞因子及炎症因子,抑制肾纤维化,减轻蛋白尿有关。
总之,Rho/ROCK在糖尿病肾病的发生、发展中有着重要的作用。本研究显示法舒地尔对糖尿病肾病具有保护作用,抑制Rho/ROCK可能为治疗糖尿病肾病提供一种新的治疗策略。但是,此过程亦决定于包括上述因素在内、还有其他多种因素之间的共同作用和平衡,法舒地尔对糖尿病肾病保护作用的具体机制,还应进一步研究。
[参考文献]
[1] Dronavalli S,Duka I,Bakris GL. The pathogenesis of diabetic nephropa thy[J]. J Nat Clin Pract Endocrinol Metab,2008,4(8):444-452.
[2] Hayashi K,Wakino S,Kanda T,et al. Molecular mechanisms and therapeutic strategies of chronic renal injury:role of rho-kinase in the development of renal injury[J]. J Pharmacol Sci,2006,100(1):29-33.
[3] Wolf G,Ziyadeh FN. Cellular and molecular mechanisms of proteinuria in diabetic nephropathy[J]. Nephron Physiol,2007,106(2):26-31.
[4] Doi K,Eoiri E,Fujita T. Role of vascular endothelial growth factor in kidney disease[J]. Curr Vasc Pharmacol,2010,8(1):122-129.
[5] Liao JK,Seto M,Noma K. Rho kinase (ROCK) inhibitors[J]. J Cardiovasc Pharmacol,2007,50(1):17-24.
[6] Ishikawa Y,Nishikimi T,Akimoto K,et al. Long-term administration of Rho-kinase inhibitor ameliorates renal damage in malignant hyper tensive rats[J]. Hypertension,2006,47:1075-1083.
[7] 马东蔚,王秋月,马小羽,等. 法舒地尔通过Rho-ROCK信号通路对高糖培养人肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化影响[J]. 中华内科杂志,2011,7(50):580-584.
(收稿日期:2013-02-21)
[关键词] 法舒地尔;糖尿病肾病;蛋白尿
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2013)13-0155-02
糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的主要并发症之一,是以微血管病变为主的肾实质病变,是糖尿病患者重要的死亡原因。临床上,DN早期表现为肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)升高,随后出现微量白蛋白尿,一旦出现显性蛋白尿,病情则不断进展,最后进入肾衰竭期,即尿毒症期。蛋白尿是糖尿病肾病发生、发展中的重要因素[1]。因此,减轻蛋白尿可延缓或阻止DN的发生和进展。近年来,研究发现Rho激酶抑制剂可作用于多种细胞,通过抑制Rho/ROCK信号通路,改善肾脏血流动力学,抑制氧化应激、细胞因子及炎症因子,减轻蛋白尿,从而延缓糖尿病肾病的发生、发展[2]。本研究旨在观察Rho激酶抑制剂法舒地尔对糖尿病肾病大鼠蛋白尿的影响,了解其在糖尿病肾病中的有益作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选取Sprague-Dawely雄性大鼠30只(SPF级,湖北省实验动物中心提供),体重约200~250 g。盐酸法舒地尔注射液 (商品名:川威,天津红日药业股份有限公司生产)。
1.2 建立动物模型
将30只大鼠常规喂养1周,测定血糖正常后随机分为三组:Ⅰ组:对照组10只;Ⅱ组:糖尿病肾病组10只,Ⅲ组:法舒地尔治疗组10只。糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组腹腔注射STZ 60 mg/kg,72 h后连续3 d测定尾血随机血糖≥16.7 mmol/L为成功模型。建模成功后,对照组及糖尿病肾病组每天给予等量的生理盐水腹腔注射,法舒地尔治疗组给予法舒地尔10 mg/(kg·d)腹腔注射,连续12周。对于建模成功的糖尿病肾病组和法舒地尔组大鼠不予胰岛素处理,三组动物饲养条件相同。均无动物意外死亡。
1.3 标本的收集
实验结束前1天,将大鼠置入代谢笼,收集24 h尿液,测定24 h尿蛋白水平;腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉大鼠,心尖部取血,离心分离血清后测定尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平。
1.4 统计学处理
实验所得数据均用SPSS13.0软件包处理,数据用均数±标准差(x±s)表示;采用方差分析进行多组资料的比较。以P < 0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 24 h尿蛋白结果
24 h尿蛋白水平糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组均明显高于对照组(P < 0.01),表明糖尿病肾病组和法舒地尔治疗组的糖尿病肾病建模成功。见表1。
2.2 法舒地尔对糖尿病肾病大鼠24 h尿蛋白、血BUN、Scr的影响
与糖尿病肾病组比较,法舒地尔治疗组24 h尿蛋白、血Scr、BUN水平明显下降(P < 0.01)。
3 讨论
DN尿蛋白的发生机制很复杂,可能是肾脏血流动力学异常、肾小球滤过屏障受损、肾小管重吸收异常、多种生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)及晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)等多个因素综合作用的结果[3]。糖代谢紊乱可引起血管紧张素Ⅱ(angiotension-Ⅱ,Ang-Ⅱ)、血管紧张素转化酶(angiotension converting enzyme,ACE)、内皮素(endothelin,ET)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、血管内皮细胞生长因子(vascular endotheliar growth factor,VEGF)等一系列血管活性因子活性增强,这些因素可使肾小球入球动脉扩张程度明显强于出球动脉,从而使肾小球出现高灌注、高滤过,促使血浆蛋白从肾小球滤过增加。另外,VEGF还能通过作用于内皮细胞上的受体,使其通透性增加,导致血浆蛋白滤过增加[4]。
Rho/Rho激酶(Rho/ROCK)是具有信息传导和分子开关功能的信号多肽[5]。它可以通过调节细胞内蛋白骨架的聚合状态对细胞形态、细胞粘附与迁移、细胞增殖与凋亡、平滑肌收缩等多种细胞功能进行调节。研究发现,激活的Rho/ROCK能上调激活蛋白(AP)-1、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β)等,下调内皮型一氧化氮合酶(eNOS),从而增强Ca2 依赖的血管平滑肌收缩,促进平滑肌细胞的增殖,促进肾脏纤维化,从而导致肾脏血流动力学异常、肾小球滤过屏障受损、肾小管重吸收异常等,促进糖尿病肾病的发展[2]。法舒地尔(fasudil)是Rho/ROCK信号通路选择性抑制剂。Ishikawa等[6]研究表明,长期的法舒地尔治疗能够减少细胞外基质的产生,抑制单核-巨噬细胞的浸润和氧化应激,上调eNOS的表达,从而达到保护肾脏的作用。马东蔚等[7]研究发现法舒地尔通过抑制高糖培养的人肾小球系膜细胞的Rho/ROCK信号转导通路,从而降低下游的炎症因子和细胞因子的分泌,减少炎症反应及纤维化,延缓糖尿病肾病的进展。 本研究结果显示,给予法舒地尔治疗12周后,法舒地尔治疗组24 h尿蛋白水平、血BUN、Scr水平明显均低于糖尿病肾病组,具有显著性差异(P < 0.01),提示法舒地尔能减少糖尿病肾病大鼠蛋白尿,改善肾脏功能,具有肾脏保护作用。其机制与法舒地尔通过抑制Rho/ROCK信号通路,改善肾脏血流动力学,抑制氧化应激、细胞因子及炎症因子,抑制肾纤维化,减轻蛋白尿有关。
总之,Rho/ROCK在糖尿病肾病的发生、发展中有着重要的作用。本研究显示法舒地尔对糖尿病肾病具有保护作用,抑制Rho/ROCK可能为治疗糖尿病肾病提供一种新的治疗策略。但是,此过程亦决定于包括上述因素在内、还有其他多种因素之间的共同作用和平衡,法舒地尔对糖尿病肾病保护作用的具体机制,还应进一步研究。
[参考文献]
[1] Dronavalli S,Duka I,Bakris GL. The pathogenesis of diabetic nephropa thy[J]. J Nat Clin Pract Endocrinol Metab,2008,4(8):444-452.
[2] Hayashi K,Wakino S,Kanda T,et al. Molecular mechanisms and therapeutic strategies of chronic renal injury:role of rho-kinase in the development of renal injury[J]. J Pharmacol Sci,2006,100(1):29-33.
[3] Wolf G,Ziyadeh FN. Cellular and molecular mechanisms of proteinuria in diabetic nephropathy[J]. Nephron Physiol,2007,106(2):26-31.
[4] Doi K,Eoiri E,Fujita T. Role of vascular endothelial growth factor in kidney disease[J]. Curr Vasc Pharmacol,2010,8(1):122-129.
[5] Liao JK,Seto M,Noma K. Rho kinase (ROCK) inhibitors[J]. J Cardiovasc Pharmacol,2007,50(1):17-24.
[6] Ishikawa Y,Nishikimi T,Akimoto K,et al. Long-term administration of Rho-kinase inhibitor ameliorates renal damage in malignant hyper tensive rats[J]. Hypertension,2006,47:1075-1083.
[7] 马东蔚,王秋月,马小羽,等. 法舒地尔通过Rho-ROCK信号通路对高糖培养人肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化影响[J]. 中华内科杂志,2011,7(50):580-584.
(收稿日期:2013-02-21)