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[摘 要]建立QuEChERS-高效液相色谱-串联质联法测定灵芝中多菌灵残留的分析方法。样品经酸化乙腈提取，采用乙二胺 -N-丙基硅烷 （PSA）和无水硫酸镁吸附剂净化，以乙腈-1‰（v/v）甲酸水溶液作为流动相，在0.2mL/min流速下等度洗脱，采用C18色谱柱分离，电喷雾正离子源 （ESI+ ）、反应性监测模式（SRM）质谱检测。结果表明：在灵芝基质中，多菌灵在 1～100μg/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系（相关系数r2大于0.996），方法的检出限为0.010 mg/kg。添加水平为 0.05、0.010、0.020mg/kg时多菌灵的平均回收率为94.5%～98%，相对标准偏差范围为2.3%～7.2%，均符合农药残留检测要求。该方法高效快捷、灵敏、准确，适用于灵芝中多菌灵的快速检测。
[关键词]QuEChERS ；高效液相色谱-串联质谱；多菌灵；灵芝
中图分类号：S481.8 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）02-0187-02
0 引言
近年来，随着人们物质生活的不断富裕，人们越来越重视健康养生。灵芝，因其具有补气安神、保肝解毒、改善心血管系统、治疗糖尿病、止咳平喘、治疗眩晕不眠、心悸气短、虚劳咳喘等功效[1]，被人们广泛用来食疗养生。灵芝煲汤、灵芝泡酒、靈芝煎水等，老人长期服用可以以治疗慢性病，小孩长期服用可以增强抵抗力，强身健体，女人长期服用养颜美白，增强肌肤弹性。
多菌灵（carbendazim），化学名称2-（甲氧基氨基甲酰）苯并咪唑[2-（methoxy-carbanmoyl）-benzimidaxole]，是一种高效低毒、广谱内吸性杀菌剂，广泛用于果蔬、食用菌等多种作物生长期和储存期真菌性病害的防治。多菌灵在自然环境中降解较慢，且有一定的毒性，如果食用了多菌灵残留量过高的灵芝，严重影响其安全性和保健功效的发挥，给人们身体健康带来隐患[2]，因此，研究其检测方法对监控和加强我国果蔬、中药保健品的安全状况具有重要的意义。
目前多菌灵的检测方法有气相色谱法、紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法及离子交换法，其中紫外分光光度法选择性低，样品前处理繁琐，检测周期长，荧光分析法操作比较繁琐且易受干扰，而液相色谱法需要对样品进行衍生化处理，前处理复杂，选择性差，灵敏度受到限制，不同的样品必须采用不同的色谱条件，方法的通用性和耐用性不强。为此，本实验采用高选择性、高灵敏度的质谱检测器，以灵芝为研究对象，建立了检测多菌灵残留的QuEChERS-液相色谱-串联质谱方法。本方法通用性强，可为测定灵芝中多菌灵残留标准提供依据。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器：Acquity UPLCH-CLASS/Xero TQD液相色谱串联质谱联用仪 （美国 WATERS公司 ）； Milli-Q？Direct超纯水仪（莱伯泰科）；MISTRAL LCMS EVO LUTION氮气发生器；SIGMA Sartorius3-18ks高速冷冻离心机；美 国Organomation N-EVAP 112氮吹仪；Elmasonic超声波清洗器；IKA高速匀浆机；赛多利斯股份公司电子天平；江苏涡旋混合器；江苏摇床；
1.1.2 试剂：乙腈（色谱纯 ，德国 Merck公司）、甲酸（色谱纯 ，德国 Merck公司）、氯化钠（分析纯）、无水硫酸镁（分析纯）、石墨化炭黑（GCB）、乙二胺 -N-丙基硅烷 （PSA）、多菌灵标准品（农药标准品，环境保护部标准样品研究所）、灵芝（购于珠海某药房）。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液配制
准确称取多菌灵标准品 ，用甲醇溶解配成浓度为 100 mg /L的标准储备液，储存于冰箱。使用时先用甲醇稀释成浓度为10mg /L的标准溶液，再用灵芝基质乙腈水（1：2）稀释成浓度为5μg /L、10μg /L、20μg /L、50μg /L、100μg /L的系列标准溶液。
1.2.2 样品处理
准确称取粉碎后的灵芝 2. 0 g于 50 mL离心管中， 加入 20mL乙腈，斡旋混匀，浸泡2h，在35℃下超声15min，取出放摇床振荡15min，8000r/min离心5min，取上清液5mL，置于1mL QuEChERS管中，管中包括0.15g乙二胺 -N-丙基硅烷 （PSA）吸附剂和0.85g无水硫酸镁，摇床振荡10min，8000r/min离心5min，取上清液1mL过0.2μm有机系微孔滤膜后，于HPLC-MS分析。
1.2.3 实验条件
（1）色谱条件 ACQUITY UPLC？BEH C18柱（2.1 mm×50mm，1.7μm）；柱温为40℃；进样量：2μL。流动相乙腈-1‰甲酸水（35：65），等度洗脱，流速为0.2mL/min。
（2）质谱条件Waters Xevo？TQ MS，电喷雾离子（ESI+）源，正离子模式；扫描方式：选择反应性监测模式（SRM）；喷射电压为3000V，离子传输管温度：300℃；干燥气流量10L/min；监测离子对、碰撞能量、裂解电压等见表1.
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
本实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-1‰（v/v）甲酸水溶液和1‰（v/v）甲酸乙腈-1‰（v/v）甲酸水作为流动相时的分离效果。流动相中加入一定量的酸可以改善待测组分色谱峰的峰形，当流动相为乙腈-1‰（v/v）甲酸水溶液时，峰形良好，且在短时间内洗脱出待测组分，提高分离效果，同时避免流动相酸性过强对色谱柱造成的损害。因此最终选用乙腈-1‰（v/v）甲酸水溶液作为流动相。 2.2 质谱条件的优化
将多菌灵配制成100μg/L的标准溶液。将标准溶液在不接色谱柱的情况下直接通过液相色谱注入质谱，利用流动注射泵分别注入离子源，对其进行全扫描，确定母离子，并通过优化离子传输管电压、喷射电压、鞘气压力、辅助气压使母离子丰度及稳定性最佳；然后对化合物进行子离子扫描得到碎片信息，并对二级质谱碰撞气能量进行优化，使特征碎片离子的强度达到最大。
2.3 净化方式的选择
实验比较了三种净化方式1.不过粉剂直接过0.2μm滤膜上机，2.过乙二胺-N-丙基硅烷 （PSA）和无水硫酸镁混合粉剂，然后过滤膜上机，3.过石墨化炭黑（GCB），然后过膜后进行测定。这3种方法对比发现，样品经过石墨化炭黑（GCB）净化后，目标化合物响应明显较低，样品直接上机的，目标峰旁有杂峰出现，影响定量，而经过乙二胺-N-丙基硅烷 （PSA）和无水硫酸镁混合粉剂的目标化合物峰形良好，且响应值高，回收率高，基质影响较小。所以实验选取了乙二胺-N-丙基硅烷 （PSA）和无水硫酸镁混合粉剂进行净化。
2.4 标准曲线和检出限
将多菌灵标准储备液用灵芝基质配成浓度分别为5 μg /L、10 μg /L、20 μg /L、50 μg /L、100 μg /L的系列标准溶液。在相同的色谱及质谱条件下，测定多菌灵的峰面积。以化合物的质量浓度为横坐标，对应的响应峰值面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：多菌灵在5～100 μg /L范圍内呈线性，其线性回归方程、相关系数及检出限见表3.根据称样量和稀释体积，经大于10倍信噪比计算方法的测定下线为10μg /kg。
2.5 精密度和回收实验
在灵芝阴性样品中添加3个浓度水平的多菌灵，在最佳的色谱、质谱、净化剂条件下进行测定，计算加标回收率和相对标准偏差，结果见表3.
3 结论
本方法研究以酸化乙腈为提取剂，样品经PSA和无水硫酸镁吸附剂净化，建立了灵芝中多菌灵的QuEChERS-高效液相色谱-串联质联检测方法。该方法灵敏度高，重复性好，操作简单，便捷，快速，适用于灵芝中多菌灵的快速准确检测。
参考文献
[1] 张建新，杜双奎，杨小姣.陕西省主要蔬菜产区多菌灵农药残留分析与评价[J].安全与环境学报，2005，5（6）：78-78
[2] 林郁.农药应用大全[M].北京：中国农业出版社，1989：140；
[关键词]QuEChERS ；高效液相色谱-串联质谱；多菌灵；灵芝
中图分类号：S481.8 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）02-0187-02
0 引言
近年来，随着人们物质生活的不断富裕，人们越来越重视健康养生。灵芝，因其具有补气安神、保肝解毒、改善心血管系统、治疗糖尿病、止咳平喘、治疗眩晕不眠、心悸气短、虚劳咳喘等功效[1]，被人们广泛用来食疗养生。灵芝煲汤、灵芝泡酒、靈芝煎水等，老人长期服用可以以治疗慢性病，小孩长期服用可以增强抵抗力，强身健体，女人长期服用养颜美白，增强肌肤弹性。
多菌灵（carbendazim），化学名称2-（甲氧基氨基甲酰）苯并咪唑[2-（methoxy-carbanmoyl）-benzimidaxole]，是一种高效低毒、广谱内吸性杀菌剂，广泛用于果蔬、食用菌等多种作物生长期和储存期真菌性病害的防治。多菌灵在自然环境中降解较慢，且有一定的毒性，如果食用了多菌灵残留量过高的灵芝，严重影响其安全性和保健功效的发挥，给人们身体健康带来隐患[2]，因此，研究其检测方法对监控和加强我国果蔬、中药保健品的安全状况具有重要的意义。
目前多菌灵的检测方法有气相色谱法、紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法及离子交换法，其中紫外分光光度法选择性低，样品前处理繁琐，检测周期长，荧光分析法操作比较繁琐且易受干扰，而液相色谱法需要对样品进行衍生化处理，前处理复杂，选择性差，灵敏度受到限制，不同的样品必须采用不同的色谱条件，方法的通用性和耐用性不强。为此，本实验采用高选择性、高灵敏度的质谱检测器，以灵芝为研究对象，建立了检测多菌灵残留的QuEChERS-液相色谱-串联质谱方法。本方法通用性强，可为测定灵芝中多菌灵残留标准提供依据。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器：Acquity UPLCH-CLASS/Xero TQD液相色谱串联质谱联用仪 （美国 WATERS公司 ）； Milli-Q？Direct超纯水仪（莱伯泰科）；MISTRAL LCMS EVO LUTION氮气发生器；SIGMA Sartorius3-18ks高速冷冻离心机；美 国Organomation N-EVAP 112氮吹仪；Elmasonic超声波清洗器；IKA高速匀浆机；赛多利斯股份公司电子天平；江苏涡旋混合器；江苏摇床；
1.1.2 试剂：乙腈（色谱纯 ，德国 Merck公司）、甲酸（色谱纯 ，德国 Merck公司）、氯化钠（分析纯）、无水硫酸镁（分析纯）、石墨化炭黑（GCB）、乙二胺 -N-丙基硅烷 （PSA）、多菌灵标准品（农药标准品，环境保护部标准样品研究所）、灵芝（购于珠海某药房）。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液配制
准确称取多菌灵标准品 ，用甲醇溶解配成浓度为 100 mg /L的标准储备液，储存于冰箱。使用时先用甲醇稀释成浓度为10mg /L的标准溶液，再用灵芝基质乙腈水（1：2）稀释成浓度为5μg /L、10μg /L、20μg /L、50μg /L、100μg /L的系列标准溶液。
1.2.2 样品处理
准确称取粉碎后的灵芝 2. 0 g于 50 mL离心管中， 加入 20mL乙腈，斡旋混匀，浸泡2h，在35℃下超声15min，取出放摇床振荡15min，8000r/min离心5min，取上清液5mL，置于1mL QuEChERS管中，管中包括0.15g乙二胺 -N-丙基硅烷 （PSA）吸附剂和0.85g无水硫酸镁，摇床振荡10min，8000r/min离心5min，取上清液1mL过0.2μm有机系微孔滤膜后，于HPLC-MS分析。
1.2.3 实验条件
（1）色谱条件 ACQUITY UPLC？BEH C18柱（2.1 mm×50mm，1.7μm）；柱温为40℃；进样量：2μL。流动相乙腈-1‰甲酸水（35：65），等度洗脱，流速为0.2mL/min。
（2）质谱条件Waters Xevo？TQ MS，电喷雾离子（ESI+）源，正离子模式；扫描方式：选择反应性监测模式（SRM）；喷射电压为3000V，离子传输管温度：300℃；干燥气流量10L/min；监测离子对、碰撞能量、裂解电压等见表1.
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
本实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-1‰（v/v）甲酸水溶液和1‰（v/v）甲酸乙腈-1‰（v/v）甲酸水作为流动相时的分离效果。流动相中加入一定量的酸可以改善待测组分色谱峰的峰形，当流动相为乙腈-1‰（v/v）甲酸水溶液时，峰形良好，且在短时间内洗脱出待测组分，提高分离效果，同时避免流动相酸性过强对色谱柱造成的损害。因此最终选用乙腈-1‰（v/v）甲酸水溶液作为流动相。 2.2 质谱条件的优化
将多菌灵配制成100μg/L的标准溶液。将标准溶液在不接色谱柱的情况下直接通过液相色谱注入质谱，利用流动注射泵分别注入离子源，对其进行全扫描，确定母离子，并通过优化离子传输管电压、喷射电压、鞘气压力、辅助气压使母离子丰度及稳定性最佳；然后对化合物进行子离子扫描得到碎片信息，并对二级质谱碰撞气能量进行优化，使特征碎片离子的强度达到最大。
2.3 净化方式的选择
实验比较了三种净化方式1.不过粉剂直接过0.2μm滤膜上机，2.过乙二胺-N-丙基硅烷 （PSA）和无水硫酸镁混合粉剂，然后过滤膜上机，3.过石墨化炭黑（GCB），然后过膜后进行测定。这3种方法对比发现，样品经过石墨化炭黑（GCB）净化后，目标化合物响应明显较低，样品直接上机的，目标峰旁有杂峰出现，影响定量，而经过乙二胺-N-丙基硅烷 （PSA）和无水硫酸镁混合粉剂的目标化合物峰形良好，且响应值高，回收率高，基质影响较小。所以实验选取了乙二胺-N-丙基硅烷 （PSA）和无水硫酸镁混合粉剂进行净化。
2.4 标准曲线和检出限
将多菌灵标准储备液用灵芝基质配成浓度分别为5 μg /L、10 μg /L、20 μg /L、50 μg /L、100 μg /L的系列标准溶液。在相同的色谱及质谱条件下，测定多菌灵的峰面积。以化合物的质量浓度为横坐标，对应的响应峰值面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：多菌灵在5～100 μg /L范圍内呈线性，其线性回归方程、相关系数及检出限见表3.根据称样量和稀释体积，经大于10倍信噪比计算方法的测定下线为10μg /kg。
2.5 精密度和回收实验
在灵芝阴性样品中添加3个浓度水平的多菌灵，在最佳的色谱、质谱、净化剂条件下进行测定，计算加标回收率和相对标准偏差，结果见表3.
3 结论
本方法研究以酸化乙腈为提取剂，样品经PSA和无水硫酸镁吸附剂净化，建立了灵芝中多菌灵的QuEChERS-高效液相色谱-串联质联检测方法。该方法灵敏度高，重复性好，操作简单，便捷，快速，适用于灵芝中多菌灵的快速准确检测。
参考文献
[1] 张建新，杜双奎，杨小姣.陕西省主要蔬菜产区多菌灵农药残留分析与评价[J].安全与环境学报，2005，5（6）：78-78
[2] 林郁.农药应用大全[M].北京：中国农业出版社，1989：140；