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摘 要:皇后帝王花(Protea magnifica)种子具有休眠性,不经任何处理难以发芽。本研究以皇后帝王花种子为试验材料,通过测定皇后帝王花种子生活力、种子萌发率、种子各部分粗提液对白菜种子发芽的影响,并以不同的方式(短时高温+变温层积、酸蚀处理+变温层积、赤霉素处理+变温层积)处理种子,研究皇后帝王花种子的休眠原因及解除方法。结果表明:试验所用皇后帝王花种子的生活力高达90.00%,但不去除种皮的完整种子30 d内不发芽。种皮粗提液不仅抑制白菜种子的发芽,还显著影响白菜种子的根与地上部分的生长。皇后帝王花种子的休眠可能是种皮的机械障碍和種皮的内源抑制物共同引起的综合休眠。时长为2 min的不同高温(40~120 ℃)处理+变温层积、不同时间(10~ 70 min)的98%浓硫酸酸蚀处理+变温层积、不同浓度(0.3、0.5、0.7 mg/L)的赤霉素溶液处理+变温层积都可以打破种子的休眠,提高皇后帝王花种子发芽率和发芽势。其中各处理分别以60 ℃的短时高温处理、30 min的酸蚀处理、0.7 mg/L的赤霉素溶液处理效果最好。综合比较,30 min的酸蚀处理为解除皇后帝王花种子休眠的最佳方法。此外,赤霉素处理对皇后帝王花种子的休眠解除有着一定的促进作用,但相比其他两种处理方式效果并不理想。
关键词:皇后帝王花;种子休眠;破除休眠;变温层积
中图分类号:S682.39 文献标识码:A
Causes of Protea magnifica Seed Dormancy and Methods for Breaking Dormancy
WU Huaiyan GUO Zhiming3, SHAN Jinfeng CHEN Jie WU Xiangchong3, LIU Zijia3, ZHU Zunling1,2,4*
1. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037, China; 2. College of Landscape Architecture, Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037, China; 3. Sanya Daxing New Landscape Ecological Co. Ltd, Sanya, Hainan 572022, China; 4. College of Arts & Design, Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037, China
Abstract: The seeds of Protea magnifica have dormancy and it is difficult to germinate without any treatment. P. magnatica seeds were used as the experimental materials. The viability, germination rate and the effects of crude extracts from different parts of seeds on the germination of Chinese cabbage were measured, and seeds were treated with different methods (short-term high temperature + variable temperature stratification, acid etching + variable temperature stratification, gibberellin treatment + variable temperature stratification) to research the dormancy reason and release method of P. magnatica seeds. The results showed that: the viability of P. magnatica seeds was as high as 90.00%, the intact seeds without removing seed coat would not germinate within 30 days. The crude extract of seed coat not only inhibited the germination of Chinese cabbage seeds, but also significantly affected the growth of its roots and aboveground parts. The seed dormancy of P. magnatica may be a combinational dormancy caused by the mechanical barrier of seed coat and the endogenous inhibitor of seed coat. Different high temperature (40-120 ℃) treatment for 2 min + variable temperature stratification, different time (10-70 min) of 98% concentrated sulfuric acid etching + variable temperature stratification and different concentrations (0.3, 0.5, 0.7 mg/L) of gibberellin solution + variable temperature stratification could break the dormancy of the seeds, and improve the germination rate and germination potential of P. magnatica seeds. Among them, short-time high temperature treatment at 60 ℃, acid etching treatment for 30 min, and 0.7 mg/L gibberellin solution treatment were the best. Comprehensive comparison, acid etching for 30 minutes was the best way to release the seed dormancy. In addition, gibberellin treatment had a certain promoting effect on the dormancy release of P. magnatica seeds, but the effect was not ideal compared with the other two treatments. Keywords: Protea magnifica; seed dormancy; dormancy breaking; variable temperature stratification
DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.026
帝王花属(Protea)植物隶属山龙眼科(Proteaceae),全世界共有130种左右,非洲大陆拥有117种,南非就有82种[1-2],由于种子在国际间的引入时间较长,且种子具有休眠特性,其引种在我国还处于栽培试验阶段[3-4]。帝王花属植物对南非的鲜切花产业具有极大的贡献,其中出口量最大的为皇后帝王花(Protea magnifica)和阔叶帝王花(P. eximia)[5]。皇后帝王花为帝王花属常绿直立或匍匐灌木[3],花两性,头状花序锥形,具有色泽艳丽的大苞片,观赏价值极高[6]。通过引进帝王花属植物,能够丰富我国鲜切花的种类,创造较高的经济效益[7]。
帝王花属植物的种子具有休眠特性,自然播种萌发率很低,需要较长的时间才能发芽[8-9]。曾力等[10]对皇后帝王花的种子进行了低温恒温处理和草木灰、赤霉素浸种处理,能够显著提高种子的发芽率与发芽势。刘艳梅等[11]利用3种浓度的木醋液浸泡帝王花(P. cynaroides)种子,显著提高了其发芽率。但目前对于皇后帝王花种子休眠的原因及解除方法的系统研究还较少。笔者课题组前期就皇后帝王花种皮特性对种子休眠的影响也进行了探究,本试验以皇后帝王花种子为材料,通过对种子生活力、种子萌发特性、种皮粗提液对白菜种子发芽的影响等方面的研究,分析皇后帝王花种子休眠的原因。并用不同的方式组合一起处理种子,探索种子休眠的解除方法,以期打破皇后帝王花种子的休眠,从而缩短种子发芽时间,提高种子发芽率,为其在我国的有性繁殖及推广应用提供理论和技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以2017年12月由哥斯达黎加引进的皇后帝王花种子为试验材料,去除瘪粒、腐坏的种粒及杂质,取新鲜饱满的帝王花种子备用。白菜(Brassica campestris)种子为‘上海青四季小白菜’,纯度≥95%,净度≥98%,含水量≤8%,发芽率≥80%。
1.2 方法
1.2.1 种子生活力测定 采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定种子生活力。随机取30粒种子,重复3次。首先,将待测皇后帝王花种子用温水浸泡24 h,剥去种皮,将去皮种子放入培养皿中,加入刚好淹没种子的0.5%TTC溶液,然后将培养皿置于30 ℃恒温培养箱内避光染色10 h,参考李炎坤等[12]的判定标准,在染色的第2、4、6、8、10 h观察皇后帝王花种子的染色情况。最后,将子叶已着色的种子分成两半,观察内部染色程度,统计并计算最终生活力。
1.2.2 种子萌发试验 选取完整的皇后帝王花种子(处理A)、去除外种皮的皇后帝王花种子(处理B)、去除内外种皮的皇后帝王花种子(处理C)各30粒,重复3次。将种子分别置于铺有滤纸的发芽盒中,加蒸馏水后放在25 ℃的人工智能气候箱内培养,若胚根能突破种皮或胚根伸长1 mm就认为可以发芽,记录各处理种子30 d内的发芽情况。
1.2.3 种子各部分粗提液生物活性测定 取新鲜饱满的皇后帝王花种子80粒,将种皮、种胚分别磨碎,称取磨碎的种皮(约1.5 g)、磨碎的种胚(约2 g),参考刘文瑜等[13]的方法制备成粗提液。将种子各部分甲醇粗提液分别稀释为原液的25%、50%、75%、100%,保存在4 ℃冰箱中备用。参考刘文瑜等[13]的方法,测定种子各部分粗提液生物活性,统计白菜种子发芽率,测量苗高与根长。
1.2.4 种子休眠的解除 (1)短时高温+变温层积处理。将皇后帝王花种子摊平置于40、60、80、100、120、140 ℃烘箱中的玻璃培养皿内处理2 min。每皿30粒种子,重复3次。2 min后,立即取出放入烧杯中冷却,以常温(25 ℃)未短时高温处理的皇后帝王花种子为对照,将种子置于25 ℃恒温状态下温水浸泡24 h。
(2)酸蚀处理+变温层积处理。将皇后帝王花种子用浓硫酸(98%)分别酸蚀处理0(CK)、10、30、50、70 min,然后置于流水中冲洗,并将种子在25 ℃恒温状态下温水浸泡24 h。每个处理重复3次,每个重复30粒种子。
(3)赤霉素浸种+变温层积处理。将皇后帝王花种子用浓度为0(CK,只加蒸馏水)、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mg/L的赤霉素溶液于25 ℃恒温状态下温水浸泡24 h。每个处理3个重复,每个重复30粒种子。
将各处理后的种子与消毒湿沙以1∶3的体积比混合,放入人工智能气候箱(光照10 h温度20 ℃/黑暗14 h温度10 ℃)中层积40 d。定期补水并翻动沙子,以保持沙子湿润和通气良好。从层积的第15天起,每天下午3:00观察并记录种子的萌发数量,并将已萌发的种子移出自封袋进行播种,层积40 d后记录结束,并计算最终发芽率、发芽势。计算公式为:
发芽率=规定时间内正常发芽种子数/种子总数×100%
发芽势=达到高峰时正常发芽种子数/种子总数×100%
1.3 数据处理
数据采用Excel 2010软件进行整理,SPSS 24.0軟件进行差异显著性分析,Excel 2010软件作图。
2 结果与分析
2.1 种子生活力
经TTC染色法测定的皇后帝王花种子,有生活力的高达90.00%,丧失生活力的有7.67%,腐坏或空粒的种子占2.33%。综合来看,试验所用的皇后帝王花种子具有较高的萌发潜力,种子生活力本身不是影响种子发芽的主要因素。 2.2 种子萌发试验
由表1可知,A处理种子在30 d内均未发芽,B处理种子发芽率为25.56%,C处理种子因为去除了内、外种皮,子叶变软,容易发霉,导致发芽率(8.89%)不高。这说明皇后帝王花种皮的某些特性是导致种子休眠的原因。
2.3 种子各部分粗提液生物活性
2.3.1 种子各部分粗提液对白菜种子发芽率的影响 由图1可看出,皇后帝王花种子不同部位的粗提液对白菜种子发芽的影响不同,与CK相比,种胚粗提液对白菜种子的发芽率影响差别不大,而种皮粗提液对白菜种子发芽率的影响非常明显。随着种皮粗提液浓度的升高,对白菜种子萌发的抑制效果越来越强,当种皮粗提液浓度为100%时,白菜种子的发芽率仅为68%,比CK降低了25.33%。与CK相比,浓度为25%的种皮粗提液对白菜种子发芽率的影响未达到显著差异 (P>0.05),而其他各浓度的种皮粗提液对白菜种子发芽率的影响均达到极显著水平(P<0.01),可初步确定皇后帝王花种皮中含有抑制白菜种子发芽的物质。
2.3.2 种皮粗提液对白菜苗高与根长的影响 由图2可看出,不同浓度的皇后帝王花种皮粗提液对白菜苗高与根长的影响均达到极显著水平(P<0.01)。与CK(12.09 mm,18.09 mm)相比,采用100%浓度的种皮粗提液处理后的白菜苗高仅为5.81 mm,根长仅为9.45 mm。并且,皇后帝王花种皮粗提液对白菜苗高、根长的抑制作用随着种皮粗提液浓度的升高而增强。由此可知,皇后帝王花种皮粗提液中存在的抑制物质不仅影响着白菜种子的生根,还影响它地上部分的生长。
2.4 种子休眠的解除
2.4.1 短时高温+变温层积处理对种子萌发的影响 采用时长2 min的短时高温处理再变温层积的方法对皇后帝王花种子破除休眠进行试验,结果表明,适宜的短时高温处理对皇后帝王花种子萌发具有促进作用。从图3可见,采用时长2 min的60 ℃高温处理,皇后帝王花种子的发芽率(70%)、发芽势(40%)均最高,对比CK(17.78%,7.78%),其发芽率提高了52.22%、发芽势提高了32.22%;从60 ℃开始,随着温度的升高皇后帝王花种子的发芽率逐渐降低;当温度达到140 ℃时,发芽率为0,说明时长2 min的140 ℃高温已经是皇后帝王花种子的耐受极限,让其丧失了生活力。40、60、80、100 ℃短时高温处理的皇后帝王花种子发芽率、发芽势与CK相比有着极显著的差异(P<0.01)。可见,温度对皇后帝王花种子休眠的解除至关重要,适当的增温处理可以有效提高皇后帝王花种子的发芽率和发芽势。
2.4.2 酸蚀处理+变温层积处理对种子萌发的影响 浓硫酸处理会使皇后帝王花种子的种皮结构疏松,从图4可见,经酸蚀处理的种子无论是发芽率还是发芽势都有所提高,不同酸蚀时间对皇后帝王花种子发芽率、发芽势的影响均达极显著水平(P<0.01)。酸蚀30 min的皇后帝王花种子发芽率(80.00%)、发芽势(38.89%)达最高,与CK(25.56%,15.56%)相比,分别提高了54.44%、23.33%;而随着酸蚀时间的延长,处理50、70 min的种子发芽率与发芽势逐渐降低;酸蚀70 min的皇后帝王花种子在层积过程中更容易腐烂。因此控制好皇后帝王花種子的酸蚀时间, 能够减少对种子内部的伤害,从而有效提高种子的发芽率和发芽势。
2.4.3 赤霉素浸种+变温层积处理对种子萌发的影响 从图5可见,经不同浓度的赤霉素溶液浸种后再变温层积的皇后帝王花种子发芽情况整体来看差异不大,但与CK相比其他各处理的种子发芽率与发芽势略有提升。经0.7 mg/L的赤霉素溶液处理的皇后帝王花种子的发芽率最高(35.56%),比CK(17.78%)提高了17.78%;经0.5 mg/L的赤霉素溶液处理的皇后帝王花种子的发芽势最高(21.11%),比CK(11.11%)提高了10.00%;当赤霉素溶液浓度达到0.7 mg/L时,随着浓度继续增大,皇后帝王花种子的发芽率、发芽势反而降低,说明较高浓度的赤霉素溶液会对皇后帝王花种子的萌发有一定的抑制作用,可见,适当浓度的赤霉素溶液才可以促进皇后帝王花种子的萌发。综合发芽率与发芽势情况来看,采用0.7 mg/L的赤霉素溶液处理的皇后帝王花种子萌发效果最好。
2.4.4 综合比较 综合比较(图6),可看出这3种处理方式的种子发芽情况均比CK好,酸蚀处理30 min为最佳,但发芽势比短时高温60 ℃处理的略低。方差分析显示,它们对皇后帝王花种子发芽率(F=206.42,P<0.01)、发芽势(F=45.88,P<0.01)的影响均达极显著水平。赤霉素处理对皇后帝王花种子休眠的解除有着一定的促进作用,但相比其他两种处理方式效果并不理想。
3 讨论
3.1 皇后帝王花种子的休眠原因
种子休眠是植物在长期系统的发育过程中,为了适应环境、保证自身的繁衍而形成的一种生物学特性[14-15]。皇后帝王花花朵巨大、色彩绚丽、观赏期长,是我国近年来炙手可热的观赏植物材料。种子硬实,使得皇后帝王花在大火频发的南非得以留存,但这却是其种子繁殖的一大障碍[7]。从哥斯达黎加引进的皇后帝王花种子,虽然种子生活力高达90.00%,但不经任何处理很难发芽。皇后帝王花种子的种胚能够在30 d内萌发,带有内种皮的种胚亦能萌发,但完整种子却不能萌发,这说明皇后帝王花种子的种皮具有休眠特性。皇后帝王花种子的种皮坚硬厚实、结构致密,导致皇后帝王花种皮存在机械障碍[16]。用98%的浓硫酸对皇后帝王花种子进行不同时间的处理,均可极显著提高种子的发芽率与发芽势,也证明了这一点。种子的不同部位存在的一些抑制物是种子休眠的重要原因之一[17]。内源抑制物在一些具有休眠特点的种子中很常见,酸樱桃(Prunus cerasus)种子的胚休眠是由子叶中的内源抑制物引起的,去除部分子叶可消除内源抑制物对萌发的阻碍,使幼苗得以正常生长[18]。研究表明,紫斑牡丹(Paeonia rockii)[19]、滇重楼(Paris polyphylla)[20]、金丝李(Garcinia paucinervis)[15]、野生黄瑞香(Daphne giraldii)[17]、麻花秦艽(Gentiana straminea)[21]以及乌桕(Sapium sebiferum)[22]等物种的种子中也都含有抑制种子萌发的物质。通过对皇后帝王花种子各部分粗提液进行生物活性测定后发现,其种胚中无抑制物,而种皮粗提液中含有抑制白菜种子发芽的物质,该抑制物还显著影响着白菜种子的根与地上部分的生长,并且随着种皮粗提液浓度的升高,抑制作用越发明显。种子中存在的内源抑制物种类很多,如脱落酸、香豆素、酚类、醛类等物质[23-24]。本试验虽已证明皇后帝王花种子的种皮粗提液中含有抑制种子萌发的内源抑制物,但具体为哪类物质还有待鉴别。综上可知,皇后帝王花种子的休眠是种皮障碍和种皮的内源抑制物共同引起的。 3.2 皇后帝王花种子解除休眠的方法
植物种子对高温处理比低温处理更加敏感[25],萌发前对一些植物种子进行一定时间的高温处理可以改变种皮结构,促进蛋白质的合成,增加种子萌发相关酶活性,从而促进种子萌发[26-28]。余娇娥等[27]对黄茅(Heteropogon contortus)种子进行不同温度和时长的预处理,发现在80 ℃下处理20 min的种子发芽情况最好。张辉红等[28]对4种松树种子进行不同高温不同时间的处理,发现60~120 ℃以内的短时高温处理均能提高马尾松(Pinus massoniana)与高山松(P. densata)种子的发芽率。对于不同植物的种子,因个体差异所需的温度有所不同,所以在实践操作过程中,找到适宜的温度范围及处理时间很重要。温度太高或热处理时间太长,都有可能引起种子内部酶活性降低,导致蛋白质变性,最终丧失生活力。于皇后帝王花种子而言,短时高温处理能够有效的提高种子发芽率,当温度达到60 ℃时其发芽率达70%、发芽势达40%。当温度升高到140 ℃时,在相同的变温层积时间内种子全部未萌发,说明140 ℃高温让其丧失了生活力。由此可见,皇后帝王花种子对温度具有较高的耐受性,这一特性对其在大火频发的南非得以留存有着很好的帮助。
浓硫酸处理可有效打破种子的物理休眠[29-32],经浓硫酸处理后,皇后帝王花种子表面结构疏松,角质层、栅栏层逐渐被腐蚀,形成大小不同的孔洞,减小了种皮的机械束缚。试验表明,经不同酸蚀时间处理的皇后帝王花种子,发芽时间比CK提前,发芽率、发芽势也大幅度提升。但酸蚀时间过长容易造成皇后帝王花种子内部结构受损,受损种子在潮湿的层积环境下更容易腐烂。对于本试验而言,皇后帝王花种子的酸蚀时间以30 min(发芽率80.00%、发芽势38.89%)左右为最佳。
外源赤霉素可以帮助种子增加种胚活力,弱化胚根周围组织来促进种子解除休眠[33],同时还与种子休眠有关的脱落酸有拮抗作用[34]。刘文瑜等[13]发现用浓度为0.1 mg/L的赤霉素处理蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)种子后再低温层积可以显著提高种子发芽率,李淑娴等[22]研究发现乌桕先用赤霉素(500或1000 mg/L)处理,再层积100 d可以有效解除种子休眠。卓露等[35]研究发现200 mg/L赤霉素能够显著提高喜盐鸢尾(Iris halophila)种子的萌发。本试验利用不同浓度的赤霉素溶液对皇后帝王花种子进行浸泡处理,发现各处理的发芽率、发芽势差异不大,但与CK相比其他各处理的发芽率与发芽势略有提升。经0.7 mg/L的赤霉素溶液处理的皇后帝王花种子的发芽率最高(35.56%),经0.5 mg/L的赤霉素溶液处理的皇后帝王花种子的发芽势最高(21.11%)。浓度继续升高时,皇后帝王花种子的发芽率、发芽势反而降低,说明较高浓度的赤霉素溶液不利于皇后帝王花种子的萌发。综合发芽率与发芽势情况来看,采用0.7 mg/L的赤霉素溶液处理皇后帝王花种子的萌发效果最好。
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责任编辑:沈德发
关键词:皇后帝王花;种子休眠;破除休眠;变温层积
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Causes of Protea magnifica Seed Dormancy and Methods for Breaking Dormancy
WU Huaiyan GUO Zhiming3, SHAN Jinfeng CHEN Jie WU Xiangchong3, LIU Zijia3, ZHU Zunling1,2,4*
1. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037, China; 2. College of Landscape Architecture, Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037, China; 3. Sanya Daxing New Landscape Ecological Co. Ltd, Sanya, Hainan 572022, China; 4. College of Arts & Design, Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037, China
Abstract: The seeds of Protea magnifica have dormancy and it is difficult to germinate without any treatment. P. magnatica seeds were used as the experimental materials. The viability, germination rate and the effects of crude extracts from different parts of seeds on the germination of Chinese cabbage were measured, and seeds were treated with different methods (short-term high temperature + variable temperature stratification, acid etching + variable temperature stratification, gibberellin treatment + variable temperature stratification) to research the dormancy reason and release method of P. magnatica seeds. The results showed that: the viability of P. magnatica seeds was as high as 90.00%, the intact seeds without removing seed coat would not germinate within 30 days. The crude extract of seed coat not only inhibited the germination of Chinese cabbage seeds, but also significantly affected the growth of its roots and aboveground parts. The seed dormancy of P. magnatica may be a combinational dormancy caused by the mechanical barrier of seed coat and the endogenous inhibitor of seed coat. Different high temperature (40-120 ℃) treatment for 2 min + variable temperature stratification, different time (10-70 min) of 98% concentrated sulfuric acid etching + variable temperature stratification and different concentrations (0.3, 0.5, 0.7 mg/L) of gibberellin solution + variable temperature stratification could break the dormancy of the seeds, and improve the germination rate and germination potential of P. magnatica seeds. Among them, short-time high temperature treatment at 60 ℃, acid etching treatment for 30 min, and 0.7 mg/L gibberellin solution treatment were the best. Comprehensive comparison, acid etching for 30 minutes was the best way to release the seed dormancy. In addition, gibberellin treatment had a certain promoting effect on the dormancy release of P. magnatica seeds, but the effect was not ideal compared with the other two treatments. Keywords: Protea magnifica; seed dormancy; dormancy breaking; variable temperature stratification
DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.026
帝王花属(Protea)植物隶属山龙眼科(Proteaceae),全世界共有130种左右,非洲大陆拥有117种,南非就有82种[1-2],由于种子在国际间的引入时间较长,且种子具有休眠特性,其引种在我国还处于栽培试验阶段[3-4]。帝王花属植物对南非的鲜切花产业具有极大的贡献,其中出口量最大的为皇后帝王花(Protea magnifica)和阔叶帝王花(P. eximia)[5]。皇后帝王花为帝王花属常绿直立或匍匐灌木[3],花两性,头状花序锥形,具有色泽艳丽的大苞片,观赏价值极高[6]。通过引进帝王花属植物,能够丰富我国鲜切花的种类,创造较高的经济效益[7]。
帝王花属植物的种子具有休眠特性,自然播种萌发率很低,需要较长的时间才能发芽[8-9]。曾力等[10]对皇后帝王花的种子进行了低温恒温处理和草木灰、赤霉素浸种处理,能够显著提高种子的发芽率与发芽势。刘艳梅等[11]利用3种浓度的木醋液浸泡帝王花(P. cynaroides)种子,显著提高了其发芽率。但目前对于皇后帝王花种子休眠的原因及解除方法的系统研究还较少。笔者课题组前期就皇后帝王花种皮特性对种子休眠的影响也进行了探究,本试验以皇后帝王花种子为材料,通过对种子生活力、种子萌发特性、种皮粗提液对白菜种子发芽的影响等方面的研究,分析皇后帝王花种子休眠的原因。并用不同的方式组合一起处理种子,探索种子休眠的解除方法,以期打破皇后帝王花种子的休眠,从而缩短种子发芽时间,提高种子发芽率,为其在我国的有性繁殖及推广应用提供理论和技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以2017年12月由哥斯达黎加引进的皇后帝王花种子为试验材料,去除瘪粒、腐坏的种粒及杂质,取新鲜饱满的帝王花种子备用。白菜(Brassica campestris)种子为‘上海青四季小白菜’,纯度≥95%,净度≥98%,含水量≤8%,发芽率≥80%。
1.2 方法
1.2.1 种子生活力测定 采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定种子生活力。随机取30粒种子,重复3次。首先,将待测皇后帝王花种子用温水浸泡24 h,剥去种皮,将去皮种子放入培养皿中,加入刚好淹没种子的0.5%TTC溶液,然后将培养皿置于30 ℃恒温培养箱内避光染色10 h,参考李炎坤等[12]的判定标准,在染色的第2、4、6、8、10 h观察皇后帝王花种子的染色情况。最后,将子叶已着色的种子分成两半,观察内部染色程度,统计并计算最终生活力。
1.2.2 种子萌发试验 选取完整的皇后帝王花种子(处理A)、去除外种皮的皇后帝王花种子(处理B)、去除内外种皮的皇后帝王花种子(处理C)各30粒,重复3次。将种子分别置于铺有滤纸的发芽盒中,加蒸馏水后放在25 ℃的人工智能气候箱内培养,若胚根能突破种皮或胚根伸长1 mm就认为可以发芽,记录各处理种子30 d内的发芽情况。
1.2.3 种子各部分粗提液生物活性测定 取新鲜饱满的皇后帝王花种子80粒,将种皮、种胚分别磨碎,称取磨碎的种皮(约1.5 g)、磨碎的种胚(约2 g),参考刘文瑜等[13]的方法制备成粗提液。将种子各部分甲醇粗提液分别稀释为原液的25%、50%、75%、100%,保存在4 ℃冰箱中备用。参考刘文瑜等[13]的方法,测定种子各部分粗提液生物活性,统计白菜种子发芽率,测量苗高与根长。
1.2.4 种子休眠的解除 (1)短时高温+变温层积处理。将皇后帝王花种子摊平置于40、60、80、100、120、140 ℃烘箱中的玻璃培养皿内处理2 min。每皿30粒种子,重复3次。2 min后,立即取出放入烧杯中冷却,以常温(25 ℃)未短时高温处理的皇后帝王花种子为对照,将种子置于25 ℃恒温状态下温水浸泡24 h。
(2)酸蚀处理+变温层积处理。将皇后帝王花种子用浓硫酸(98%)分别酸蚀处理0(CK)、10、30、50、70 min,然后置于流水中冲洗,并将种子在25 ℃恒温状态下温水浸泡24 h。每个处理重复3次,每个重复30粒种子。
(3)赤霉素浸种+变温层积处理。将皇后帝王花种子用浓度为0(CK,只加蒸馏水)、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mg/L的赤霉素溶液于25 ℃恒温状态下温水浸泡24 h。每个处理3个重复,每个重复30粒种子。
将各处理后的种子与消毒湿沙以1∶3的体积比混合,放入人工智能气候箱(光照10 h温度20 ℃/黑暗14 h温度10 ℃)中层积40 d。定期补水并翻动沙子,以保持沙子湿润和通气良好。从层积的第15天起,每天下午3:00观察并记录种子的萌发数量,并将已萌发的种子移出自封袋进行播种,层积40 d后记录结束,并计算最终发芽率、发芽势。计算公式为:
发芽率=规定时间内正常发芽种子数/种子总数×100%
发芽势=达到高峰时正常发芽种子数/种子总数×100%
1.3 数据处理
数据采用Excel 2010软件进行整理,SPSS 24.0軟件进行差异显著性分析,Excel 2010软件作图。
2 结果与分析
2.1 种子生活力
经TTC染色法测定的皇后帝王花种子,有生活力的高达90.00%,丧失生活力的有7.67%,腐坏或空粒的种子占2.33%。综合来看,试验所用的皇后帝王花种子具有较高的萌发潜力,种子生活力本身不是影响种子发芽的主要因素。 2.2 种子萌发试验
由表1可知,A处理种子在30 d内均未发芽,B处理种子发芽率为25.56%,C处理种子因为去除了内、外种皮,子叶变软,容易发霉,导致发芽率(8.89%)不高。这说明皇后帝王花种皮的某些特性是导致种子休眠的原因。
2.3 种子各部分粗提液生物活性
2.3.1 种子各部分粗提液对白菜种子发芽率的影响 由图1可看出,皇后帝王花种子不同部位的粗提液对白菜种子发芽的影响不同,与CK相比,种胚粗提液对白菜种子的发芽率影响差别不大,而种皮粗提液对白菜种子发芽率的影响非常明显。随着种皮粗提液浓度的升高,对白菜种子萌发的抑制效果越来越强,当种皮粗提液浓度为100%时,白菜种子的发芽率仅为68%,比CK降低了25.33%。与CK相比,浓度为25%的种皮粗提液对白菜种子发芽率的影响未达到显著差异 (P>0.05),而其他各浓度的种皮粗提液对白菜种子发芽率的影响均达到极显著水平(P<0.01),可初步确定皇后帝王花种皮中含有抑制白菜种子发芽的物质。
2.3.2 种皮粗提液对白菜苗高与根长的影响 由图2可看出,不同浓度的皇后帝王花种皮粗提液对白菜苗高与根长的影响均达到极显著水平(P<0.01)。与CK(12.09 mm,18.09 mm)相比,采用100%浓度的种皮粗提液处理后的白菜苗高仅为5.81 mm,根长仅为9.45 mm。并且,皇后帝王花种皮粗提液对白菜苗高、根长的抑制作用随着种皮粗提液浓度的升高而增强。由此可知,皇后帝王花种皮粗提液中存在的抑制物质不仅影响着白菜种子的生根,还影响它地上部分的生长。
2.4 种子休眠的解除
2.4.1 短时高温+变温层积处理对种子萌发的影响 采用时长2 min的短时高温处理再变温层积的方法对皇后帝王花种子破除休眠进行试验,结果表明,适宜的短时高温处理对皇后帝王花种子萌发具有促进作用。从图3可见,采用时长2 min的60 ℃高温处理,皇后帝王花种子的发芽率(70%)、发芽势(40%)均最高,对比CK(17.78%,7.78%),其发芽率提高了52.22%、发芽势提高了32.22%;从60 ℃开始,随着温度的升高皇后帝王花种子的发芽率逐渐降低;当温度达到140 ℃时,发芽率为0,说明时长2 min的140 ℃高温已经是皇后帝王花种子的耐受极限,让其丧失了生活力。40、60、80、100 ℃短时高温处理的皇后帝王花种子发芽率、发芽势与CK相比有着极显著的差异(P<0.01)。可见,温度对皇后帝王花种子休眠的解除至关重要,适当的增温处理可以有效提高皇后帝王花种子的发芽率和发芽势。
2.4.2 酸蚀处理+变温层积处理对种子萌发的影响 浓硫酸处理会使皇后帝王花种子的种皮结构疏松,从图4可见,经酸蚀处理的种子无论是发芽率还是发芽势都有所提高,不同酸蚀时间对皇后帝王花种子发芽率、发芽势的影响均达极显著水平(P<0.01)。酸蚀30 min的皇后帝王花种子发芽率(80.00%)、发芽势(38.89%)达最高,与CK(25.56%,15.56%)相比,分别提高了54.44%、23.33%;而随着酸蚀时间的延长,处理50、70 min的种子发芽率与发芽势逐渐降低;酸蚀70 min的皇后帝王花种子在层积过程中更容易腐烂。因此控制好皇后帝王花種子的酸蚀时间, 能够减少对种子内部的伤害,从而有效提高种子的发芽率和发芽势。
2.4.3 赤霉素浸种+变温层积处理对种子萌发的影响 从图5可见,经不同浓度的赤霉素溶液浸种后再变温层积的皇后帝王花种子发芽情况整体来看差异不大,但与CK相比其他各处理的种子发芽率与发芽势略有提升。经0.7 mg/L的赤霉素溶液处理的皇后帝王花种子的发芽率最高(35.56%),比CK(17.78%)提高了17.78%;经0.5 mg/L的赤霉素溶液处理的皇后帝王花种子的发芽势最高(21.11%),比CK(11.11%)提高了10.00%;当赤霉素溶液浓度达到0.7 mg/L时,随着浓度继续增大,皇后帝王花种子的发芽率、发芽势反而降低,说明较高浓度的赤霉素溶液会对皇后帝王花种子的萌发有一定的抑制作用,可见,适当浓度的赤霉素溶液才可以促进皇后帝王花种子的萌发。综合发芽率与发芽势情况来看,采用0.7 mg/L的赤霉素溶液处理的皇后帝王花种子萌发效果最好。
2.4.4 综合比较 综合比较(图6),可看出这3种处理方式的种子发芽情况均比CK好,酸蚀处理30 min为最佳,但发芽势比短时高温60 ℃处理的略低。方差分析显示,它们对皇后帝王花种子发芽率(F=206.42,P<0.01)、发芽势(F=45.88,P<0.01)的影响均达极显著水平。赤霉素处理对皇后帝王花种子休眠的解除有着一定的促进作用,但相比其他两种处理方式效果并不理想。
3 讨论
3.1 皇后帝王花种子的休眠原因
种子休眠是植物在长期系统的发育过程中,为了适应环境、保证自身的繁衍而形成的一种生物学特性[14-15]。皇后帝王花花朵巨大、色彩绚丽、观赏期长,是我国近年来炙手可热的观赏植物材料。种子硬实,使得皇后帝王花在大火频发的南非得以留存,但这却是其种子繁殖的一大障碍[7]。从哥斯达黎加引进的皇后帝王花种子,虽然种子生活力高达90.00%,但不经任何处理很难发芽。皇后帝王花种子的种胚能够在30 d内萌发,带有内种皮的种胚亦能萌发,但完整种子却不能萌发,这说明皇后帝王花种子的种皮具有休眠特性。皇后帝王花种子的种皮坚硬厚实、结构致密,导致皇后帝王花种皮存在机械障碍[16]。用98%的浓硫酸对皇后帝王花种子进行不同时间的处理,均可极显著提高种子的发芽率与发芽势,也证明了这一点。种子的不同部位存在的一些抑制物是种子休眠的重要原因之一[17]。内源抑制物在一些具有休眠特点的种子中很常见,酸樱桃(Prunus cerasus)种子的胚休眠是由子叶中的内源抑制物引起的,去除部分子叶可消除内源抑制物对萌发的阻碍,使幼苗得以正常生长[18]。研究表明,紫斑牡丹(Paeonia rockii)[19]、滇重楼(Paris polyphylla)[20]、金丝李(Garcinia paucinervis)[15]、野生黄瑞香(Daphne giraldii)[17]、麻花秦艽(Gentiana straminea)[21]以及乌桕(Sapium sebiferum)[22]等物种的种子中也都含有抑制种子萌发的物质。通过对皇后帝王花种子各部分粗提液进行生物活性测定后发现,其种胚中无抑制物,而种皮粗提液中含有抑制白菜种子发芽的物质,该抑制物还显著影响着白菜种子的根与地上部分的生长,并且随着种皮粗提液浓度的升高,抑制作用越发明显。种子中存在的内源抑制物种类很多,如脱落酸、香豆素、酚类、醛类等物质[23-24]。本试验虽已证明皇后帝王花种子的种皮粗提液中含有抑制种子萌发的内源抑制物,但具体为哪类物质还有待鉴别。综上可知,皇后帝王花种子的休眠是种皮障碍和种皮的内源抑制物共同引起的。 3.2 皇后帝王花种子解除休眠的方法
植物种子对高温处理比低温处理更加敏感[25],萌发前对一些植物种子进行一定时间的高温处理可以改变种皮结构,促进蛋白质的合成,增加种子萌发相关酶活性,从而促进种子萌发[26-28]。余娇娥等[27]对黄茅(Heteropogon contortus)种子进行不同温度和时长的预处理,发现在80 ℃下处理20 min的种子发芽情况最好。张辉红等[28]对4种松树种子进行不同高温不同时间的处理,发现60~120 ℃以内的短时高温处理均能提高马尾松(Pinus massoniana)与高山松(P. densata)种子的发芽率。对于不同植物的种子,因个体差异所需的温度有所不同,所以在实践操作过程中,找到适宜的温度范围及处理时间很重要。温度太高或热处理时间太长,都有可能引起种子内部酶活性降低,导致蛋白质变性,最终丧失生活力。于皇后帝王花种子而言,短时高温处理能够有效的提高种子发芽率,当温度达到60 ℃时其发芽率达70%、发芽势达40%。当温度升高到140 ℃时,在相同的变温层积时间内种子全部未萌发,说明140 ℃高温让其丧失了生活力。由此可见,皇后帝王花种子对温度具有较高的耐受性,这一特性对其在大火频发的南非得以留存有着很好的帮助。
浓硫酸处理可有效打破种子的物理休眠[29-32],经浓硫酸处理后,皇后帝王花种子表面结构疏松,角质层、栅栏层逐渐被腐蚀,形成大小不同的孔洞,减小了种皮的机械束缚。试验表明,经不同酸蚀时间处理的皇后帝王花种子,发芽时间比CK提前,发芽率、发芽势也大幅度提升。但酸蚀时间过长容易造成皇后帝王花种子内部结构受损,受损种子在潮湿的层积环境下更容易腐烂。对于本试验而言,皇后帝王花种子的酸蚀时间以30 min(发芽率80.00%、发芽势38.89%)左右为最佳。
外源赤霉素可以帮助种子增加种胚活力,弱化胚根周围组织来促进种子解除休眠[33],同时还与种子休眠有关的脱落酸有拮抗作用[34]。刘文瑜等[13]发现用浓度为0.1 mg/L的赤霉素处理蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)种子后再低温层积可以显著提高种子发芽率,李淑娴等[22]研究发现乌桕先用赤霉素(500或1000 mg/L)处理,再层积100 d可以有效解除种子休眠。卓露等[35]研究发现200 mg/L赤霉素能够显著提高喜盐鸢尾(Iris halophila)种子的萌发。本试验利用不同浓度的赤霉素溶液对皇后帝王花种子进行浸泡处理,发现各处理的发芽率、发芽势差异不大,但与CK相比其他各处理的发芽率与发芽势略有提升。经0.7 mg/L的赤霉素溶液处理的皇后帝王花种子的发芽率最高(35.56%),经0.5 mg/L的赤霉素溶液处理的皇后帝王花种子的发芽势最高(21.11%)。浓度继续升高时,皇后帝王花种子的发芽率、发芽势反而降低,说明较高浓度的赤霉素溶液不利于皇后帝王花种子的萌发。综合发芽率与发芽势情况来看,采用0.7 mg/L的赤霉素溶液处理皇后帝王花种子的萌发效果最好。
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责任编辑:沈德发