【摘 要】
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目的 克隆表达及纯化屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus,Der p)第13组变应原(Der p13)蛋白,并鉴定其免疫原性.方法 提取屋尘螨总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
【机 构】
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深圳大学过敏反应与免疫学研究所,广东深圳518060;深圳大学第三附属医院变态反应科,广东深圳518060
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目的 克隆表达及纯化屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus,Der p)第13组变应原(Der p13)蛋白,并鉴定其免疫原性.方法 提取屋尘螨总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术获得Der p13的cDNA片段.正确设计引物,利用已获得的cDNA片段进行PCR扩增,获得Der p13基因片段.将扩增产物连接到载体上并转入克隆菌Top10中,挑选阳性菌落,保菌取样送到上海生工生物有限公司进行测序.将测序正确的基因转入表达载体PET-24a中,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达和镍柱亲和层析法纯化重组蛋白Der p13.使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及免疫印迹(Western Blot)鉴定纯化产物.结果 成功构建表达了质粒PET-24a-Derp 13,SDS-PAGE电泳结果显示上清可溶性蛋白表达量较多,分子质量约为13 000.免疫印迹结果表明该蛋白可与尘螨过敏患者血清结合,具有一定免疫原性,重组蛋白Der p13三级结构预测表明其主要是β折叠,根据DNAStar抗原指数、亲水性、表面可及性、柔韧性等数据可以推导出蛋白Der p13抗原区,重组蛋白Der p13进化树分析结果显示屋尘螨与粉尘螨、疥、害嗜鳞螨及储存螨同源性较高.结论 成功克隆表达、纯化出Der p13重组蛋白,该蛋白具有一定的免疫原性,为临床实验研究过敏性疾病的诊断与治疗奠定基础.
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