【摘 要】
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目的 建立检测微量HIV-1 K103N耐药突变的等位基因特异扩增实时定量PCR(allele-specific real-time PCR,ASPCR)方法,用于微量K103N耐药突变的检测和分析.方法 首先建立检测K1
【机 构】
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军事医学科学院微生物流行病研究所全军艾滋病检测中心,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京,100071
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目的 建立检测微量HIV-1 K103N耐药突变的等位基因特异扩增实时定量PCR(allele-specific real-time PCR,ASPCR)方法,用于微量K103N耐药突变的检测和分析.方法 首先建立检测K103N耐药突变的ASPCR方法,然后对方法进行验证,最后采用ASPCR方法检测对照样本.构建含K103N突变的质粒作为标准品,然后设计特异性引物用以区分野生型和突变型模板,采用SYBR green法进行实时定量PCR,并绘制标准曲线.分别采用特异性和非特异性引物扩增模板,根据二者Ct(cycle threshold)值结合相应的标准曲线判断是否存在K103N突变及突变比例.对ASPCR检测K103N突变位点的特异性、敏感性、准确性、重复性等进行验证.结果 特异性和非特异性引物扩增等量野生型模板的Ct值之差(△Ct)可达13.56;当突变比例小于0.1%时仍具有良好的准确性;批内变异系数小于0.7,批间变异系数小于1.6;检测灵敏度可达0.01%.检测阴性对照样本的△Ct显著高于临界值,阳性对照样本检测结果均为刚性.结论 ASPCR是一种快速、灵敏、准确的检测HIV-1微量耐药突变的方法,可为临床抗病毒治疗提供理论指导.
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