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摘要：目的考察三七多糖（PNP）的毒理学安全性。方法进行急性经口毒性试验；三项遗传毒性试验（Ames试验、骨髓微核试验、小鼠精子畸形试验）；30天喂养试验。结果以最大给药量（剂量为30000 mg·kg-1 W）的样品给予小鼠灌胃后，未见动物有中毒症状，无动物死亡，试验结束解剖动物，大体观察未见异常，急性经口毒性属无毒级；三项遗传毒性试验结果均为阴性；以2670、2000、1335 mg·kg-1 W（分别相当于人体推荐用量100、75、50倍）3个剂量的样品连续给大鼠灌胃30 d，实验期间动物的生长发育良好，各剂量组的动物体重、增重量、进食量、食物利用率、血常规指标、血生化指标、脏器重量及脏器/体重比值与对照组比较，均无显著性差异（P>0.05）；大体解剖观察和组织病理学检查未见与样品有关的异常改变。在受试剂量范围内未见该样品对大鼠各项观察指标产生毒副作用。结论三七多糖具有良好的安全性。
关键词：三七多糖；安全性；急性毒性；遗传毒性；30天喂养试验
中图分类号：R965.3文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）12-0056-05
【Abstract】Objective： To study the toxicological safety of Panax Notoginseng polysaccharide （PNP）. Methods： Acute oral toxicity test， three genotoxicity tests （Ames test， bone marrow micronucleus test and mouse sperm abnormality test） and 30 days feeding test were conducted. Results： After the mice were given gavage with the maximal dose （30000 mg·kg-1 W）， no animals were poisoned and no animals were killed. At the end of the experiments， the animals were dissected and no abnormalities were observed. The acute oral toxicity was non-toxic. The three genotoxicity test results were negative. The rats were given gavage with 2670， 2000 and 1335 mg·kg-1 W （respectively equivalent to the weight of human body recommended dose 100， 75 and 50 times） for 30 days. The growth and development of the animals during the experiments were good. Compared with those of the control group， the weight， weight gain， food intake， food utilization， blood index， blood biochemical index， organ weight and organ/body weight ratio of each group with different doses had no significant difference （P>0.05）. There were no abnormal changes related to the samples in the gross anatomy and histopathological examination. In the dose range of the samples，the side effects of various indicators of rat toxicity were not seen. Conclusion： Panax notoginseng polysaccharide has good safety.
【Key words】Panax notoginseng polysaccharide， safety， acute toxicity， genotoxicity， 30-day feeding test
三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]為五加科人参属多年生草本植物，又名参三七、田七等名。三七自古以来是传统的名贵中药材，主产地云南文山。三七的化学研究始于二十世纪三十年代，而随着配糖体成分分离和结构鉴定技术的发展，自八十年代以来才有显著进展[1]。三七中的化学成分，包括皂苷（saponins），多糖（polysaccharides），黄酮（flavonoids），聚炔醇（polyalkynols），氨基酸（amino acids）和脂肪酸（fatty acids），以及环肽类（cyclopeptides）等，但目前对三七的研究主要集中在皂苷类化合物，对其他有效成分的研究不足。多糖几乎存在于所有的动物、植物及微生物体内，参与机体生理代谢，具有降血糖、降血脂、预防和治疗糖尿病、抗肿瘤、抗氧化等生理功能[2-6]，因此备受关注。本课题组多年来从事三七资源的开发利用，从提取过三七皂苷的三七废渣中，提出了含量为56.70%，得率为1.71%（三七干燥药材的百分比）的三七多糖[7]；发现三七多糖可提高小鼠的细胞免疫与体液免疫[8]；能延长荷肝癌H22小鼠生存期[9]。为了进一步开发利用三七多糖，本文研究其毒理学安全性，以期为三七多糖的开发应用提供依据。 1材料
1.1试药、试剂三七多糖 取适量提取三七皂苷后的三七废渣，第一次加入10倍量水，沸水浴煮8h，收集滤液，第二次加入5倍量水，沸水浴8h。合并两次滤液，4500 rpm离心5 min，取上清。80℃旋转浓缩至原体积的1/8，静置24 h，离心，弃沉淀，缓慢加入三倍无水乙醇，边加边搅拌，4℃放置12h，抽滤得沉淀。75%乙醇洗涤沉淀数次，将乙醇挥发干后用适量水溶解，离心，收集上清，加入三倍无水乙醇，4℃放置12h，抽滤得沉淀，75%乙醇洗涤沉淀，50℃烘箱烘干，即得三七多糖试药。
环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司）、小牛血清（Gibco公司）、TA97a、TA98、TA100、TA102标准菌株、S9、2-氨基芴、柔毛霉素、敌克松、叠氮钠、1，8-二羟基蒽醌、吉姆萨（Giemsa）染色试剂盒（上海哥凡生物科技有限公司）、伊红染色液、甲醇等。
1.2动物、仪器SPF级健康昆明种小鼠[由广西医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（桂）2009-0002，实验动物质量合格证号：0001270，SPF级健康SD种大鼠]由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（粤）2008-0002，质量合格证号：0081568，SPF级实验动物使用许可证号：SYXK（桂）2007-0003。实验动物室温度：22～25 ℃，相对湿度：55～70%。
实验室常用解剖器械、电子天平、培养皿、恒温培养箱、载玻片、光学显微镜、血液分析仪、全自动生化分析仪（德国Roche 规格型号Cobas c311）。
2方法
2.1小鼠急性经口毒性试验采用最大给药量试验法，选体重18～22 g的昆明种小鼠20只，雌雄各半。试验前动物禁食16 h，不限饮水。称取50.0 g样品，加纯水至100 mL，混匀、配成500 mg·mL-1浓度溶液，然后给动物灌胃3次（每次间隔4h），每次灌胃量为0.02 mL·g-1 BW，合计剂量为30000 mg·kg-1 BW。灌胃后观察、记录动物的中毒表现。每周称重一次，观察两周时间，试验结束解剖动物进行大体观察。按毒性分级标准评价受试物的急性毒性。
2.2Ames 试验采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四种菌株进行试验。称取5.0 g样品，加纯水溶解至100 mL，配成50 mg·mL-1浓度溶液，再依次5倍稀释（取10 mL 加纯水至50 mL），分别配成10、2、0.4、0.08 mg·mL-1 浓度溶液，共5个浓度受试溶液，经高压灭菌（0.103 Mpa 20 min）处理后供试验用。以多氯聯苯诱导的大鼠肝微粒体酶（S-9）作为体外代谢活化系统。采用平板掺入法，在保温的顶层培养基中依次加入0.1 mL试验菌株增菌液、0.1 mL受试物溶液和0.5 mL S-9混合液（当需要代谢活化时），混匀后倒入底层培养基平板上。5个试验剂量分别为5000、1000、200、40、8 μg/皿，同时设自发回变对照、溶剂对照和阳性突变剂对照。自发回变对照除不加样品外，其余条件与样品组相同。溶剂对照用灭菌纯水替代样品，其余条件与样品组相同。每个剂量组的各种菌株均做3个平行皿。在37 ℃下培养48 h，计数每皿的菌落数。整套试验在相同条件下重复做两次。如果受试物的回变菌落数增加超过自发回变菌落数的2倍以上，并具有剂量-反应关系者，即为诱变试验阳性。
2.3小鼠骨髓细胞微核试验采用间隔24小时两次经口灌胃法进行试验。选体重为25～30 g 的昆明种小鼠50只，随机分成5组，每组10只，雌雄各半。试验组3个剂量分别设10000、5000、2500 mg·kg-1 BW以纯水为阴性对照，40 mg·kg-1 BW剂量的环磷酰胺（cp）作阳性对照。分别称取20.0、10.0、5.0 g样品，各加纯水至40 mL，混匀、配成500、250、125 mg·mL-1浓度溶液，然后按0.02 mL·g-1 BW的体积给动物灌胃，阴性对照组灌给等体积的纯水，阳性对照组灌给等体积的2 mg·mL-1环磷酰胺溶液。第二次给样后6小时颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞（PCE），微核率以含微核的PCE千分率计，同时计数200个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值（PCE/NCE）。采用泊松分布均数比较法统计处理。如试验组的微核率比阴性对照组增高，并有明显的剂量-反应关系和统计学意义，即为阳性结果。
2.4小鼠精子畸形试验选体重为25～35 g的昆明种雄性小鼠50只，随机分成5组，每组10只。试验组3个剂量分别设10000、5000、2500 mg·kg-1 BW，以纯水为阴性对照，40 mg·kg-1 BW剂量的环磷酰胺（cp）作阳性对照。分别称取20.0、10.0、5.0 g样品，各加纯水至40 mL，混匀、配成500、250、125 mg·mL-1浓度溶液，然后按0.02 mL·g-1 BW的体积给动物灌胃，阴性对照灌给等体积的纯水，阳性对照组灌给等体积的2 mg·mL-1环磷酰胺溶液。每天灌胃一次，连续5天。末次给样后第30天处死动物，取副睾的精子涂片，甲醇固定，伊红染色。在光学显微镜下，每只动物计数完整精子1000个，计算精子畸形率，采用χ2检验统计处理。如试验组的精子畸形率比阴性对照组增高，并有明显的剂量-反应关系和统计学意义，即为阳性结果。
2.5大鼠30天喂养试验
2.5.1剂量选择与受试物给予方式选SD种大鼠80只，雌雄各半，雄鼠体重（70.2±4.7）g，雌鼠体重（65.0±3.8）g。将动物随机分为4组，即阴性对照组和3个试验组，每组20只，雌雄各半。3个试验组剂量分别设为2670、2000、1335 mg·kg-1 BW，分别相当于人体推荐剂量的100、75、50倍。分别称取26.70、20.00、13.35 g样品，各加纯水至100 mL，混匀、配成267.0、200.0、133.5mg·mL-1浓度溶液，按10.0 mL·kg-1 BW的体积给相应剂量组动物灌胃，阴性对照组灌给等体积的纯水，每天灌胃一次，连续灌胃30 d。 2.5.2实验方法实验期间所有动物给予普通饲料，单笼饲养，自由摄食饮水。每天观察动物的活动和生长情况，每周加食2次，记录给食量和剩食量，每周称一次体重，计算每周进食量和食物利用率。实验结束动物禁食过夜，次日早上称动物空腹体重，然后处死大鼠，采2份血样，一份血抗凝用血球计数仪检测Hb、RBC、WBC及其分类、PLT等；另一份血不抗凝分离血清，用试剂盒和全自动生化分析仪检测血清AST、ALT、BUN、Cr、TC、Tg，Glu、TP、Alb等項目。采血后解剖动物，
进行大体观察，取肝脏、肾脏、脾脏和睾丸等脏器进行称重，计算脏/体比值，取肝脏、肾脏、脾脏、胃、十二指肠、睾丸和卵巢等脏器进行病理组织学检查。在对各剂量组动物作大体检查未发现明显病变和生化指标改变时，只进行高剂量组和对照组动物的主要脏器的组织病理学检查，如发现病变则对中、低剂量组相应器官及组织进行检查。
2.5.3实验数据统计应用SPSS统计软件进行单因素方差分析。在统计分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用Dunnett检验进行多个剂量组与对照组均数间的两两比较。若方差不齐则对数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计；若转换数据仍未达到方差齐要求，改用秩和检验进行统计分析。
3结果
3.1急性经口毒性试验采用最大给药量的样品给小鼠灌胃后，观察小鼠14天，雄性小鼠初始、第7天、第14天平均体重分别为（20.0±0.4）g，（26.3±1.0）g，（32.2±1.3）g，雌性小鼠初始、第7天、第14天平均体重分别为（20.2±0.6）g，（26.0±0.9）g，（30.9±1.3）g，小鼠生长良好，体重未受影响。无中毒症状，未发现死亡小鼠。试验结束解剖动物、大体观察，肝、肾等主要脏器均未见明显异常改变，根据急性毒性分级标准，三七多糖的急性经口毒性属无毒级。
3.2Ames试验从表1、表2可见，受试物的回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，也无剂量-反应关系，该受试物诱变试验结果为阴性。
3.3小鼠骨髓细胞微核试验试验组3个剂量分别是10000、5000、2500 mg·kg-1 BW。雄性小鼠组，微核发生率（‰）分别为（0.6±0.5）、（1.2±0.8）、（1.0±0.0），与阴性对照组（1.2±0.4）无显著性差异（P>0.05），阳性对照组（26.2±2.8）与阴性对照组有显著性差异（P<0.01）。雌性小鼠组，微核发生率（‰）分别为（1.0±0.7）、（1.2±0.4）、（0.8±0.8），与阴性对照组（1.4±0.9）无显著性差异（P>0.05），阳性对照组（24.4±4.0）与阴性对照组有显著性差异（P<0.01）。表明三七多糖对小鼠的骨髓细胞无损伤作用。
3.4小鼠精子畸形试验试验组3个剂量分别设10000、5000、2500 mg·kg-1 BW，小鼠精子畸形发生率（%）分别为（1.37±0.37）、（1.43±0.29）、（1.39±0.19）与阴性对照组（1.45±0.23）无显著性差异（P>0.05），阳性对照组（4.32±0.48）与阴性对照组有显著性差异（P<0.01）。表明三七多糖对小鼠精子无畸变作用。
3.5大鼠30 d喂养试验
3.5.1动物一般表现实验期间，观察各组大鼠，生长发育良好，未见有异常行为、中毒表现、死亡现象。
3.5.2三七多糖对大鼠体重及食物利用率的影响结果见表3，以2670、2000、1335 mg·kg-1 BW剂量的三七多糖给大鼠灌胃30天，实验期间，三七多糖各剂量组大鼠的体重、增重量、进食量、食物利用率等指标与对照组无显著性差异（P>0.05），表明三七多糖对大鼠的体重及食物利用率无明显影响。
3.5.4三七多糖对大鼠血液生化指标的影响结果见表5，以 2670、2000、1335 mg·kg-1 BW 剂量的三七多糖给大鼠灌胃30天，各剂量组大鼠的AST、ALT、BUN、Cr、TC、Tg，Glu、TP、Alb对照组无显著性差异（P>0.05），表明三七多糖对大鼠的血液生化指标无明显影响。
3.5.5三七多糖对大鼠脏器重量及脏器/体重比值的影响以2670、2000、1335 mg·kg-1 BW 剂量的三七多糖给大鼠灌胃30天，采血后解剖动物，进行大体观察，取肝脏、肾脏、脾脏和睾丸等脏器进行称重，计算脏/体比值，各剂量组大鼠的脏器重量及脏器/体重比值与对照组无显著性差异（P>0.05），表明三七多糖对大鼠的脏器重量及脏器/体重比值无明显影响。
3.5.6解剖大体观察及组织学检查结果实验结束解剖动物，大体观察各组动物均未发现明显病变。故只选三七多糖的高剂量组和阴性对照组动物的主要脏器进行组织病理切片检查。结果显示，高剂量组有1只雌性、对照组有1只雄性和1只雌性大鼠的肝脏组织可见肝细胞点状坏死，高剂量组有1只雄性、对照组有1只雄性和1只雌性大鼠的肝脏汇管区可见少量炎细胞浸润；两组均有1只雄性和1只雌性大鼠的肾脏皮质部间质可见少量炎细胞浸润。以上组织病变属动物的自发轻型病变，且两组动物的组织病变程度相似，故可以排除是三七多糖所致，其他脏器组织未见病理组织学改变，表明三七多糖对大鼠的上述脏器组织无损害作用。
4结论
以最大给药量（剂量为30000 mg·kg-1 BW）的三七多糖给予小鼠灌胃后，未见动物有中毒症状和死亡，急性经口毒性属无毒级。
三项遗传毒性试验（Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验）结果均为阴性。30天喂养试验，以2670、2000、1335 mg·kg-1 BW 3个剂量（分别相当于人体推荐用量100、75、50倍）的三七多糖连续给大鼠灌胃30天，实验期间动物生长发育良好，各剂量组大鼠的体重、增重量、进食量、食物利用率、血常规指标、血液生化指标、脏器重量及脏器/体重比值等均未受明显影响；大体解剖观察和组织病理学检查未见与三七多糖有关的异常改变。在受试剂量范围内未见三七多糖对大鼠各项观察指标产生毒副作用。 致谢：感谢广西壮族自治区疾病预防控制中心毒理室对本项目的支持。参考文献：
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（收稿日期：2017-10-24）
关键词：三七多糖；安全性；急性毒性；遗传毒性；30天喂养试验
中图分类号：R965.3文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）12-0056-05
【Abstract】Objective： To study the toxicological safety of Panax Notoginseng polysaccharide （PNP）. Methods： Acute oral toxicity test， three genotoxicity tests （Ames test， bone marrow micronucleus test and mouse sperm abnormality test） and 30 days feeding test were conducted. Results： After the mice were given gavage with the maximal dose （30000 mg·kg-1 W）， no animals were poisoned and no animals were killed. At the end of the experiments， the animals were dissected and no abnormalities were observed. The acute oral toxicity was non-toxic. The three genotoxicity test results were negative. The rats were given gavage with 2670， 2000 and 1335 mg·kg-1 W （respectively equivalent to the weight of human body recommended dose 100， 75 and 50 times） for 30 days. The growth and development of the animals during the experiments were good. Compared with those of the control group， the weight， weight gain， food intake， food utilization， blood index， blood biochemical index， organ weight and organ/body weight ratio of each group with different doses had no significant difference （P>0.05）. There were no abnormal changes related to the samples in the gross anatomy and histopathological examination. In the dose range of the samples，the side effects of various indicators of rat toxicity were not seen. Conclusion： Panax notoginseng polysaccharide has good safety.
【Key words】Panax notoginseng polysaccharide， safety， acute toxicity， genotoxicity， 30-day feeding test
三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]為五加科人参属多年生草本植物，又名参三七、田七等名。三七自古以来是传统的名贵中药材，主产地云南文山。三七的化学研究始于二十世纪三十年代，而随着配糖体成分分离和结构鉴定技术的发展，自八十年代以来才有显著进展[1]。三七中的化学成分，包括皂苷（saponins），多糖（polysaccharides），黄酮（flavonoids），聚炔醇（polyalkynols），氨基酸（amino acids）和脂肪酸（fatty acids），以及环肽类（cyclopeptides）等，但目前对三七的研究主要集中在皂苷类化合物，对其他有效成分的研究不足。多糖几乎存在于所有的动物、植物及微生物体内，参与机体生理代谢，具有降血糖、降血脂、预防和治疗糖尿病、抗肿瘤、抗氧化等生理功能[2-6]，因此备受关注。本课题组多年来从事三七资源的开发利用，从提取过三七皂苷的三七废渣中，提出了含量为56.70%，得率为1.71%（三七干燥药材的百分比）的三七多糖[7]；发现三七多糖可提高小鼠的细胞免疫与体液免疫[8]；能延长荷肝癌H22小鼠生存期[9]。为了进一步开发利用三七多糖，本文研究其毒理学安全性，以期为三七多糖的开发应用提供依据。 1材料
1.1试药、试剂三七多糖 取适量提取三七皂苷后的三七废渣，第一次加入10倍量水，沸水浴煮8h，收集滤液，第二次加入5倍量水，沸水浴8h。合并两次滤液，4500 rpm离心5 min，取上清。80℃旋转浓缩至原体积的1/8，静置24 h，离心，弃沉淀，缓慢加入三倍无水乙醇，边加边搅拌，4℃放置12h，抽滤得沉淀。75%乙醇洗涤沉淀数次，将乙醇挥发干后用适量水溶解，离心，收集上清，加入三倍无水乙醇，4℃放置12h，抽滤得沉淀，75%乙醇洗涤沉淀，50℃烘箱烘干，即得三七多糖试药。
环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司）、小牛血清（Gibco公司）、TA97a、TA98、TA100、TA102标准菌株、S9、2-氨基芴、柔毛霉素、敌克松、叠氮钠、1，8-二羟基蒽醌、吉姆萨（Giemsa）染色试剂盒（上海哥凡生物科技有限公司）、伊红染色液、甲醇等。
1.2动物、仪器SPF级健康昆明种小鼠[由广西医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（桂）2009-0002，实验动物质量合格证号：0001270，SPF级健康SD种大鼠]由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（粤）2008-0002，质量合格证号：0081568，SPF级实验动物使用许可证号：SYXK（桂）2007-0003。实验动物室温度：22～25 ℃，相对湿度：55～70%。
实验室常用解剖器械、电子天平、培养皿、恒温培养箱、载玻片、光学显微镜、血液分析仪、全自动生化分析仪（德国Roche 规格型号Cobas c311）。
2方法
2.1小鼠急性经口毒性试验采用最大给药量试验法，选体重18～22 g的昆明种小鼠20只，雌雄各半。试验前动物禁食16 h，不限饮水。称取50.0 g样品，加纯水至100 mL，混匀、配成500 mg·mL-1浓度溶液，然后给动物灌胃3次（每次间隔4h），每次灌胃量为0.02 mL·g-1 BW，合计剂量为30000 mg·kg-1 BW。灌胃后观察、记录动物的中毒表现。每周称重一次，观察两周时间，试验结束解剖动物进行大体观察。按毒性分级标准评价受试物的急性毒性。
2.2Ames 试验采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四种菌株进行试验。称取5.0 g样品，加纯水溶解至100 mL，配成50 mg·mL-1浓度溶液，再依次5倍稀释（取10 mL 加纯水至50 mL），分别配成10、2、0.4、0.08 mg·mL-1 浓度溶液，共5个浓度受试溶液，经高压灭菌（0.103 Mpa 20 min）处理后供试验用。以多氯聯苯诱导的大鼠肝微粒体酶（S-9）作为体外代谢活化系统。采用平板掺入法，在保温的顶层培养基中依次加入0.1 mL试验菌株增菌液、0.1 mL受试物溶液和0.5 mL S-9混合液（当需要代谢活化时），混匀后倒入底层培养基平板上。5个试验剂量分别为5000、1000、200、40、8 μg/皿，同时设自发回变对照、溶剂对照和阳性突变剂对照。自发回变对照除不加样品外，其余条件与样品组相同。溶剂对照用灭菌纯水替代样品，其余条件与样品组相同。每个剂量组的各种菌株均做3个平行皿。在37 ℃下培养48 h，计数每皿的菌落数。整套试验在相同条件下重复做两次。如果受试物的回变菌落数增加超过自发回变菌落数的2倍以上，并具有剂量-反应关系者，即为诱变试验阳性。
2.3小鼠骨髓细胞微核试验采用间隔24小时两次经口灌胃法进行试验。选体重为25～30 g 的昆明种小鼠50只，随机分成5组，每组10只，雌雄各半。试验组3个剂量分别设10000、5000、2500 mg·kg-1 BW以纯水为阴性对照，40 mg·kg-1 BW剂量的环磷酰胺（cp）作阳性对照。分别称取20.0、10.0、5.0 g样品，各加纯水至40 mL，混匀、配成500、250、125 mg·mL-1浓度溶液，然后按0.02 mL·g-1 BW的体积给动物灌胃，阴性对照组灌给等体积的纯水，阳性对照组灌给等体积的2 mg·mL-1环磷酰胺溶液。第二次给样后6小时颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞（PCE），微核率以含微核的PCE千分率计，同时计数200个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值（PCE/NCE）。采用泊松分布均数比较法统计处理。如试验组的微核率比阴性对照组增高，并有明显的剂量-反应关系和统计学意义，即为阳性结果。
2.4小鼠精子畸形试验选体重为25～35 g的昆明种雄性小鼠50只，随机分成5组，每组10只。试验组3个剂量分别设10000、5000、2500 mg·kg-1 BW，以纯水为阴性对照，40 mg·kg-1 BW剂量的环磷酰胺（cp）作阳性对照。分别称取20.0、10.0、5.0 g样品，各加纯水至40 mL，混匀、配成500、250、125 mg·mL-1浓度溶液，然后按0.02 mL·g-1 BW的体积给动物灌胃，阴性对照灌给等体积的纯水，阳性对照组灌给等体积的2 mg·mL-1环磷酰胺溶液。每天灌胃一次，连续5天。末次给样后第30天处死动物，取副睾的精子涂片，甲醇固定，伊红染色。在光学显微镜下，每只动物计数完整精子1000个，计算精子畸形率，采用χ2检验统计处理。如试验组的精子畸形率比阴性对照组增高，并有明显的剂量-反应关系和统计学意义，即为阳性结果。
2.5大鼠30天喂养试验
2.5.1剂量选择与受试物给予方式选SD种大鼠80只，雌雄各半，雄鼠体重（70.2±4.7）g，雌鼠体重（65.0±3.8）g。将动物随机分为4组，即阴性对照组和3个试验组，每组20只，雌雄各半。3个试验组剂量分别设为2670、2000、1335 mg·kg-1 BW，分别相当于人体推荐剂量的100、75、50倍。分别称取26.70、20.00、13.35 g样品，各加纯水至100 mL，混匀、配成267.0、200.0、133.5mg·mL-1浓度溶液，按10.0 mL·kg-1 BW的体积给相应剂量组动物灌胃，阴性对照组灌给等体积的纯水，每天灌胃一次，连续灌胃30 d。 2.5.2实验方法实验期间所有动物给予普通饲料，单笼饲养，自由摄食饮水。每天观察动物的活动和生长情况，每周加食2次，记录给食量和剩食量，每周称一次体重，计算每周进食量和食物利用率。实验结束动物禁食过夜，次日早上称动物空腹体重，然后处死大鼠，采2份血样，一份血抗凝用血球计数仪检测Hb、RBC、WBC及其分类、PLT等；另一份血不抗凝分离血清，用试剂盒和全自动生化分析仪检测血清AST、ALT、BUN、Cr、TC、Tg，Glu、TP、Alb等項目。采血后解剖动物，
进行大体观察，取肝脏、肾脏、脾脏和睾丸等脏器进行称重，计算脏/体比值，取肝脏、肾脏、脾脏、胃、十二指肠、睾丸和卵巢等脏器进行病理组织学检查。在对各剂量组动物作大体检查未发现明显病变和生化指标改变时，只进行高剂量组和对照组动物的主要脏器的组织病理学检查，如发现病变则对中、低剂量组相应器官及组织进行检查。
2.5.3实验数据统计应用SPSS统计软件进行单因素方差分析。在统计分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用Dunnett检验进行多个剂量组与对照组均数间的两两比较。若方差不齐则对数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计；若转换数据仍未达到方差齐要求，改用秩和检验进行统计分析。
3结果
3.1急性经口毒性试验采用最大给药量的样品给小鼠灌胃后，观察小鼠14天，雄性小鼠初始、第7天、第14天平均体重分别为（20.0±0.4）g，（26.3±1.0）g，（32.2±1.3）g，雌性小鼠初始、第7天、第14天平均体重分别为（20.2±0.6）g，（26.0±0.9）g，（30.9±1.3）g，小鼠生长良好，体重未受影响。无中毒症状，未发现死亡小鼠。试验结束解剖动物、大体观察，肝、肾等主要脏器均未见明显异常改变，根据急性毒性分级标准，三七多糖的急性经口毒性属无毒级。
3.2Ames试验从表1、表2可见，受试物的回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，也无剂量-反应关系，该受试物诱变试验结果为阴性。
3.3小鼠骨髓细胞微核试验试验组3个剂量分别是10000、5000、2500 mg·kg-1 BW。雄性小鼠组，微核发生率（‰）分别为（0.6±0.5）、（1.2±0.8）、（1.0±0.0），与阴性对照组（1.2±0.4）无显著性差异（P>0.05），阳性对照组（26.2±2.8）与阴性对照组有显著性差异（P<0.01）。雌性小鼠组，微核发生率（‰）分别为（1.0±0.7）、（1.2±0.4）、（0.8±0.8），与阴性对照组（1.4±0.9）无显著性差异（P>0.05），阳性对照组（24.4±4.0）与阴性对照组有显著性差异（P<0.01）。表明三七多糖对小鼠的骨髓细胞无损伤作用。
3.4小鼠精子畸形试验试验组3个剂量分别设10000、5000、2500 mg·kg-1 BW，小鼠精子畸形发生率（%）分别为（1.37±0.37）、（1.43±0.29）、（1.39±0.19）与阴性对照组（1.45±0.23）无显著性差异（P>0.05），阳性对照组（4.32±0.48）与阴性对照组有显著性差异（P<0.01）。表明三七多糖对小鼠精子无畸变作用。
3.5大鼠30 d喂养试验
3.5.1动物一般表现实验期间，观察各组大鼠，生长发育良好，未见有异常行为、中毒表现、死亡现象。
3.5.2三七多糖对大鼠体重及食物利用率的影响结果见表3，以2670、2000、1335 mg·kg-1 BW剂量的三七多糖给大鼠灌胃30天，实验期间，三七多糖各剂量组大鼠的体重、增重量、进食量、食物利用率等指标与对照组无显著性差异（P>0.05），表明三七多糖对大鼠的体重及食物利用率无明显影响。
3.5.4三七多糖对大鼠血液生化指标的影响结果见表5，以 2670、2000、1335 mg·kg-1 BW 剂量的三七多糖给大鼠灌胃30天，各剂量组大鼠的AST、ALT、BUN、Cr、TC、Tg，Glu、TP、Alb对照组无显著性差异（P>0.05），表明三七多糖对大鼠的血液生化指标无明显影响。
3.5.5三七多糖对大鼠脏器重量及脏器/体重比值的影响以2670、2000、1335 mg·kg-1 BW 剂量的三七多糖给大鼠灌胃30天，采血后解剖动物，进行大体观察，取肝脏、肾脏、脾脏和睾丸等脏器进行称重，计算脏/体比值，各剂量组大鼠的脏器重量及脏器/体重比值与对照组无显著性差异（P>0.05），表明三七多糖对大鼠的脏器重量及脏器/体重比值无明显影响。
3.5.6解剖大体观察及组织学检查结果实验结束解剖动物，大体观察各组动物均未发现明显病变。故只选三七多糖的高剂量组和阴性对照组动物的主要脏器进行组织病理切片检查。结果显示，高剂量组有1只雌性、对照组有1只雄性和1只雌性大鼠的肝脏组织可见肝细胞点状坏死，高剂量组有1只雄性、对照组有1只雄性和1只雌性大鼠的肝脏汇管区可见少量炎细胞浸润；两组均有1只雄性和1只雌性大鼠的肾脏皮质部间质可见少量炎细胞浸润。以上组织病变属动物的自发轻型病变，且两组动物的组织病变程度相似，故可以排除是三七多糖所致，其他脏器组织未见病理组织学改变，表明三七多糖对大鼠的上述脏器组织无损害作用。
4结论
以最大给药量（剂量为30000 mg·kg-1 BW）的三七多糖给予小鼠灌胃后，未见动物有中毒症状和死亡，急性经口毒性属无毒级。
三项遗传毒性试验（Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验）结果均为阴性。30天喂养试验，以2670、2000、1335 mg·kg-1 BW 3个剂量（分别相当于人体推荐用量100、75、50倍）的三七多糖连续给大鼠灌胃30天，实验期间动物生长发育良好，各剂量组大鼠的体重、增重量、进食量、食物利用率、血常规指标、血液生化指标、脏器重量及脏器/体重比值等均未受明显影响；大体解剖观察和组织病理学检查未见与三七多糖有关的异常改变。在受试剂量范围内未见三七多糖对大鼠各项观察指标产生毒副作用。 致谢：感谢广西壮族自治区疾病预防控制中心毒理室对本项目的支持。参考文献：
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（收稿日期：2017-10-24）