【摘 要】
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目的表达、纯化Tgo DNA聚合酶,并检测其扩增性能。方法采用PCR技术从嗜热古细菌Thermococcus gorgonarius中扩增Tgo DNA聚合酶基因,并克隆至含His-Tag靶序列的pET101载体中,
【机 构】
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长春师范学院生命科学学院; 解放军总医院皮肤科;
【基金项目】
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国际合作项目(20062200135);吉林省自然科学基金项目(20060723)
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目的表达、纯化Tgo DNA聚合酶,并检测其扩增性能。方法采用PCR技术从嗜热古细菌Thermococcus gorgonarius中扩增Tgo DNA聚合酶基因,并克隆至含His-Tag靶序列的pET101载体中,转化E.coliBL21Sta(rDE3),IPTG诱导表达。目的蛋白纯化后经SDS-PAGE分析,并利用标准pfu酶,采用对比法初略测定酶活性;以质粒pUC19为模板,用Tgo酶和pfu酶进行PCR扩增,比较二者的扩增效率,采用改进的蓝白试验法检测Tgo酶的扩增忠实性。结果 PCR扩增的Tgo DNA聚合酶基因大小约2300bp,根据测序获得的基因序列推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的序列一致。表达的目的蛋白为可溶性蛋白,相对分子质量约为89000,表达量为350μg/gE.coli,50%甘油保存的酶活性约为5U/μl。Tgo酶和pfu酶的扩增产出率和忠实性均相当。结论成功表达并纯化了Tgo DNA聚合酶,其扩增性能与pfu酶相当。
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