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摘要：为了对羊口疮病毒（ ORFV） AH-FlO株/27基因进行原核表达及亚细胞定位，本试验采用PCR方法扩增出ORFV127基因，成功构建原核表达重组质粒pGEX-6p-1—ORFV127和真核重组质粒pECFP-N1- ORFV127。将原核表达重组质粒转化到大肠埃希氏菌中表达，并进行纯化和鉴定。以纯化的蛋白质免疫BALB/e雌鼠制备多克隆抗体，利用Western-blot技术鉴定其反应原性。利用脂质体介导法将重组质粒pEGFP-N1-ORFV/27转染至Vero细胞，通过倒置荧光显微镜观察其在细胞中的表达及亚细胞定位。结果表明，获得的ORFV127基因序列全长为558bp，ORFV127蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，主要以包涵体蛋白质的形式表达，大小约49 000。Western-blot结果显示，免疫小鼠获得的抗ORFV127蛋白的多克隆抗体可特异性识别ORFV127蛋白，倒置荧光显微镜观察发现，ORFV127蛋白主要定位于细胞质。本试验结果为后续研究ORFV127蛋白的功能提供了宝贵的生物材料。
关键词：羊口疮病毒;ORFV127基因;原核表达;亚细胞定位
中图分类号：S855.3
文献标识码：A
文章编号： 1000-4440（2019）03-0646-07
羊口疮，即羊传染性脓疱，是由痘病毒科、副痘病毒属的羊口疮病毒（ Orf virus，ORFV）引起的绵羊、山羊、人、红鹿、松鼠和驯鹿等多种动物的一种急性、接触性、嗜上皮性人兽共患病，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和结成疣状结痂为特征，且主要引起皮肤和黏膜的增生性病变，3-6月龄的羔羊最易感染，成年羊发病较少[1-4]。ORFV导致的死亡率不高，但若混合其他病原感染时，死亡率会显著升高[5]。自19世纪50年代起，中国10余个省份不断有羊口疮疫情的相关报道，目前该病主要流行于中国西北地区，对中国畜牧养殖业造成了较大的危害[6-7]。
口疮病毒基因组为线性双链DNA，其全长约为138 kb。基因组由中央核心基因和末端基因组成[8]。中央核心基因（ORFV009 - ORFV111）相对保守，主要参与调控病毒粒子在细胞浆中的装配成熟以及病毒的复制、包装和释放，两侧末端基因（OR-FVO01 - ORFV008、ORFV12 - ORFV134、主要為与病毒的毒力、宿主嗜性、免疫逃避和免疫调节有关的基因，这些基因具有较高的种间变异性，且大多与病毒的致病机制有关，因此末端变异区具有重要的研究价值[9-13];本试验研究的ORFV127基因位于基因组的3’UTR，编码白介素-10（vIL-IO），是ORFV早期表达的基因之一[14]。
本试验拟以羊口疮病毒AH-F10株基因组为模板，扩增出ORFV127基因，构建重组质粒pGEX-6p-1-ORFV127和pEGFP-NI-ORFV/27，结合Western-blot及亚细胞定位等技术，获得了抗ORFV127蛋白的多克隆抗体及ORFV127基因在真核细胞中的表达情况，以期为后续研究ORFV127蛋白的生物学功能以及ORFV与宿主细胞相互作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
DH5a和Rosetta（ DE3）感受态细胞购自TaKaRa公司，ORFV AH-F10株[15]、pGEX-6p-l载体及Vero细胞由本实验室保存，6周龄SPF级BALB/c雌鼠购自安徽医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（皖）2017-001。
1.2 主要试剂
Solution I、rTaq DNA聚合酶、pMD19-T载体、限制性内切酶EcoR I和Bam H I均购自TaKaRa公司，质粒小提试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒购自Axygen公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自Tiangen公司，谷胱甘肽S一转移酶（ GST）标签鼠源单抗、羊抗小鼠IgG/HRP购自ZSGB-BIO公司，二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自Boster公司，增强化学发光（ECL）试剂盒、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000、改良杜氏伊格尔培养基（ DMEM）、胎牛血清（FBS）购自Ther-moFisher公司，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液购自Beyotime公司，其余试剂均为国产分析纯。
1.3 0RFV127基因的扩增
根据GenBank上公布的ORFV127基因序列（ No. KP010354.1），通过Primer Premier 5.0软件设计2对引物用于扩增ORFV127基因，预期扩增产物大小为558 bp。上、下游引物序列为：ORFV127-（pGEX-6p-l）up：5’-CGGGATCCATGTCGAACAA-CAAAAITCT-3’（下划线处为添加的Bam H I酶切位点），ORFV127-（ pGEX-6p-l）dw：5’-GGAAT-TCrITATGATTTAGTAGTCATGTATGAT_3’（下划线处为添加的Eco R I酶切位点），ORFV127-（ pEGFP-N1） up：5’_GGAAITCTGATGTCGAACAACAAAArITCT_3’（下划线处为添加的Eco R I酶切位点），ORFV127-（ pEGFP-NI） dw：5’-CGGGATCCCGTGATITAGTAGT-CATGTATGAT-3’（下划线处为添加的Bam H I酶切位点）。引物由上海生物工程有限公司合成。
采用合成的引物PCR扩增ORFV127基因，PCR扩增条件：95℃预变性5 min：95℃变性50 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环后，72℃再延伸10 min。PCR扩增体系：rTaq DNA聚合酶Mix 10μl，AH-FIO株基因组模板1μl，上、下游引物各1μl，补加灭菌ddH，O至20μl。PCR产物按胶回收试剂盒步骤回收纯化后克隆至pMD19-T载体，并进行PCR、双酶切及序列测定，对测序结果进行分析。 1.4 0RFV127基因重组质粒的构建
将鉴定正确的质粒经Eco R I和Bam H I酶切后分别克隆至同样经双酶切的pGEX-6p-l及pEGFP-N1载体中。菌液PCR扩增、双酶切鉴定阳性克隆，将测序正确的重组质粒分别命名为pGEX-6p-l-ORFV/27和pEGFP-N1-ORFV/27.
1.5 重组蛋白质的诱导及纯化
将重组表达质粒pGEX-6p-l-ORFV/27转化至Rosetta感受态细胞。挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的溶菌肉汤（ LB）液体培养基中，37℃恒温摇床振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入异丙基-p-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为l mmol/L，33 0C恒温摇床振荡培养3-6 h后离心收集菌体进行SDS-PAGE电泳。采用常规包涵体洗涤、尿素复性及蔗糖浓缩方法[16]对重组蛋白质进行纯化。
1.6 重组蛋白质的Westen-blot鉴定
将纯化后的重组蛋白质经SDS-PAGE电泳后，转膜，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，杂交膜清洗液（TBST）漂洗3次后加入1：1 000稀释的抗GST标签的鼠源单抗，37℃孵育th。TBST漂洗3次后加入1：1 000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育th。TBST漂洗3次，DAB试剂盒显色。
1.7 多克隆抗体的制备及分析
以纯化的ORFV127蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠，免疫程序参照文献[17]进行。第4次免疫7d后，从小鼠眼眶采血，分离血清。对已诱导的重组蛋白质及pGEX-6P-1对照菌蛋白质进行SDS-PAGE电泳，转膜，以制备的血清为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行Western-blot分析。
1.8 亚细胞定位分析
常规方法复苏Vero细胞，接种于6孔板中，加入含IO
关键词：羊口疮病毒;ORFV127基因;原核表达;亚细胞定位
中图分类号：S855.3
文献标识码：A
文章编号： 1000-4440（2019）03-0646-07
羊口疮，即羊传染性脓疱，是由痘病毒科、副痘病毒属的羊口疮病毒（ Orf virus，ORFV）引起的绵羊、山羊、人、红鹿、松鼠和驯鹿等多种动物的一种急性、接触性、嗜上皮性人兽共患病，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和结成疣状结痂为特征，且主要引起皮肤和黏膜的增生性病变，3-6月龄的羔羊最易感染，成年羊发病较少[1-4]。ORFV导致的死亡率不高，但若混合其他病原感染时，死亡率会显著升高[5]。自19世纪50年代起，中国10余个省份不断有羊口疮疫情的相关报道，目前该病主要流行于中国西北地区，对中国畜牧养殖业造成了较大的危害[6-7]。
口疮病毒基因组为线性双链DNA，其全长约为138 kb。基因组由中央核心基因和末端基因组成[8]。中央核心基因（ORFV009 - ORFV111）相对保守，主要参与调控病毒粒子在细胞浆中的装配成熟以及病毒的复制、包装和释放，两侧末端基因（OR-FVO01 - ORFV008、ORFV12 - ORFV134、主要為与病毒的毒力、宿主嗜性、免疫逃避和免疫调节有关的基因，这些基因具有较高的种间变异性，且大多与病毒的致病机制有关，因此末端变异区具有重要的研究价值[9-13];本试验研究的ORFV127基因位于基因组的3’UTR，编码白介素-10（vIL-IO），是ORFV早期表达的基因之一[14]。
本试验拟以羊口疮病毒AH-F10株基因组为模板，扩增出ORFV127基因，构建重组质粒pGEX-6p-1-ORFV127和pEGFP-NI-ORFV/27，结合Western-blot及亚细胞定位等技术，获得了抗ORFV127蛋白的多克隆抗体及ORFV127基因在真核细胞中的表达情况，以期为后续研究ORFV127蛋白的生物学功能以及ORFV与宿主细胞相互作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
DH5a和Rosetta（ DE3）感受态细胞购自TaKaRa公司，ORFV AH-F10株[15]、pGEX-6p-l载体及Vero细胞由本实验室保存，6周龄SPF级BALB/c雌鼠购自安徽医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（皖）2017-001。
1.2 主要试剂
Solution I、rTaq DNA聚合酶、pMD19-T载体、限制性内切酶EcoR I和Bam H I均购自TaKaRa公司，质粒小提试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒购自Axygen公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自Tiangen公司，谷胱甘肽S一转移酶（ GST）标签鼠源单抗、羊抗小鼠IgG/HRP购自ZSGB-BIO公司，二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自Boster公司，增强化学发光（ECL）试剂盒、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000、改良杜氏伊格尔培养基（ DMEM）、胎牛血清（FBS）购自Ther-moFisher公司，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液购自Beyotime公司，其余试剂均为国产分析纯。
1.3 0RFV127基因的扩增
根据GenBank上公布的ORFV127基因序列（ No. KP010354.1），通过Primer Premier 5.0软件设计2对引物用于扩增ORFV127基因，预期扩增产物大小为558 bp。上、下游引物序列为：ORFV127-（pGEX-6p-l）up：5’-CGGGATCCATGTCGAACAA-CAAAAITCT-3’（下划线处为添加的Bam H I酶切位点），ORFV127-（ pGEX-6p-l）dw：5’-GGAAT-TCrITATGATTTAGTAGTCATGTATGAT_3’（下划线处为添加的Eco R I酶切位点），ORFV127-（ pEGFP-N1） up：5’_GGAAITCTGATGTCGAACAACAAAArITCT_3’（下划线处为添加的Eco R I酶切位点），ORFV127-（ pEGFP-NI） dw：5’-CGGGATCCCGTGATITAGTAGT-CATGTATGAT-3’（下划线处为添加的Bam H I酶切位点）。引物由上海生物工程有限公司合成。
采用合成的引物PCR扩增ORFV127基因，PCR扩增条件：95℃预变性5 min：95℃变性50 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环后，72℃再延伸10 min。PCR扩增体系：rTaq DNA聚合酶Mix 10μl，AH-FIO株基因组模板1μl，上、下游引物各1μl，补加灭菌ddH，O至20μl。PCR产物按胶回收试剂盒步骤回收纯化后克隆至pMD19-T载体，并进行PCR、双酶切及序列测定，对测序结果进行分析。 1.4 0RFV127基因重组质粒的构建
将鉴定正确的质粒经Eco R I和Bam H I酶切后分别克隆至同样经双酶切的pGEX-6p-l及pEGFP-N1载体中。菌液PCR扩增、双酶切鉴定阳性克隆，将测序正确的重组质粒分别命名为pGEX-6p-l-ORFV/27和pEGFP-N1-ORFV/27.
1.5 重组蛋白质的诱导及纯化
将重组表达质粒pGEX-6p-l-ORFV/27转化至Rosetta感受态细胞。挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的溶菌肉汤（ LB）液体培养基中，37℃恒温摇床振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入异丙基-p-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为l mmol/L，33 0C恒温摇床振荡培养3-6 h后离心收集菌体进行SDS-PAGE电泳。采用常规包涵体洗涤、尿素复性及蔗糖浓缩方法[16]对重组蛋白质进行纯化。
1.6 重组蛋白质的Westen-blot鉴定
将纯化后的重组蛋白质经SDS-PAGE电泳后，转膜，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，杂交膜清洗液（TBST）漂洗3次后加入1：1 000稀释的抗GST标签的鼠源单抗，37℃孵育th。TBST漂洗3次后加入1：1 000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育th。TBST漂洗3次，DAB试剂盒显色。
1.7 多克隆抗体的制备及分析
以纯化的ORFV127蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠，免疫程序参照文献[17]进行。第4次免疫7d后，从小鼠眼眶采血，分离血清。对已诱导的重组蛋白质及pGEX-6P-1对照菌蛋白质进行SDS-PAGE电泳，转膜，以制备的血清为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行Western-blot分析。
1.8 亚细胞定位分析
常规方法复苏Vero细胞，接种于6孔板中，加入含IO