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[摘 要]RAG蛋白作为哺乳动物免疫系统抵御外界多元病原微生物干扰的“安保”系统，通过对淋巴细胞表面不同DNA片段的剪切与连接可形成多样的抗原结合区。2015年，大鼠的RAG1-RAG2复合体晶体结构的发现揭示了RAG1-RAG2复合体的形态结构和功能位点。最近的研究发现，除特异性免疫B、T细胞外，RAGs参与NK细胞发育过程。RAGs表达异常将会引起一系列的免疫缺陷疾病。了解RAGs的重组机制不仅对深入研究生物体适应性免疫和固有免疫有一定的价值并且对及时预防和治疗免疫缺陷疾病具有重要意义。
[关键词]免疫系统 RAGs V（D）J重组 NK细胞
中图分类号：TU857 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）28-0162-01
抗体对抗原的识别具有特异性。在脊椎动物的基因组中，有效基因的总体数量却是有限的。那么，有颌类脊椎动物是怎样来产生抗体的呢？上世纪80年代，Schatz和Oettinger等免疫学家在有颌类脊椎动物的免疫细胞中发现了与重组多种抗原受体密切相关的重组活化基因（recombination activating gene，RAG）。RAGs包括RAG1和RAG2，是一对在染色体上排列十分紧密的基因，主要在有颌类脊椎动物的淋巴细胞中表达。此外，在斑马鱼的非淋巴组织嗅觉神经元中也发现了RAGs。研究显示有颌类脊椎动物可依赖淋巴细胞表面的RAG来介导V（D）J重组从而产生多种抗体以低于外界病原微生物的入侵。除此之外，Jenny M. Karo及其同事还发现RAG分子在固有免疫自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）中也发挥了非常重要的作用。
1 RAG的基本结构及生物化学功能
目前研究发现来自于小鼠的RAG1分子由1040个氨基酸残基组成，第1至383位的氨基酸残基非核心区和第384至1008位的氨基酸残基核心区组成。位于RAG1核心区第389-422位的氨基酸残基能够形成二聚体与RSS的九聚物结合。重组信号序列RSS是由保守的七聚体（5-CACAGTG-3′）、九聚体（5′-ACAAAAACC-3′）和中间相对不保守的12或23bp的间隔序列形成的重组信号序列（简称12RSS或23RSS）;RAG1通过识别RSS的九聚体介导对DNA上RSS的识别作用，具有攻击双链DNA活性;位于RAG1羧基末端第761-979位的氨基酸残基可以非特异性的结合双链断裂的DNA。RAG1的非核心区含有E3泛素连接酶活性。RAG2由527个氨基酸残基组成，第1至387位的氨基酸残基为核心区、第388-527位的氨基酸残基为非核心区。RAG2的非核心区含有九聚体和锌指等结构域。此外，RAG2 的羧基末端还含有一个同源域指状结构（plant homeodomain finger，PhD）。该结构域含有能够与三甲基化组蛋白（H3K4me3）发生特异性相互作用的位点，对RAG1/2共同行使酶切功能具有重要的调节作用。2015年，Mihai Ciubotaru等人首次解析了大鼠RAG1-RAG2复合物的晶体结构在二维电子显微镜负染色（阴性染色）图像中呈“Y”型，是分子量为230kDa的异四聚体。RAG1二聚体形成“Y”，活性位点位于“Y”中间，RAG2位于“Y”型手臂的尖端。
2 淋巴细胞发育过程中V（D）J 重组发生过程
生物个体的发育要严格的按照组织、细胞的发育阶段进行调控，V（D）J 重组也要如此。淋巴细胞发育主要经历了从祖B 淋巴细胞、前B 淋巴细胞、未成熟B 淋巴细胞至成熟的B 淋巴细胞的过程。V（D） J 重排过程主要发生在淋巴细胞的未成熟阶段。V（D） J 重排主要分为两步：（1）.RSS处位点特异性酶切;（2）.非同源末端连接。在淋巴细胞表面，排列着大量独立的V、D、J基因片段，在这些基因片段的两侧含有12或23标记的RSS，RSS是由富含A、T的九聚体和高保守性的具有回文结构的七聚体及其相对不保守的间隔序列（12或23bp）组成。RSS的七聚物（ heptamer， 5’CACAGTG3’）与基因片段的连接处是RAG1识别的分子标记。RAG1作为生物体内行使“核酸内切酶”功能的基因，其与RAG2结合成复合体后，同高迁移率组蛋白（HMGB1）一起去识别12或23 RSS后起始V（D）J重组。重组遵守12/23规则。RAGs在识别携带12或23RSS的基因片段后，RAGs将DNA双链中一条链“切开”，使其形成单个信号复合体，而后，RAGs-HMGB1复合体快速去识别DNA双链中另一条反向互补DNA链中符合12/23规则的RSS，将其快速切断，双链DNA两侧断裂形成环状发卡结构编码序列。对于不同的抗原，携带不同的RSS标记的基因片段在特异性的核酸内切酶Artemis的帮助下将两侧发卡结构编码序列打开，而后在一些修复蛋白（包括Ku70、Ku80、XRCC4、DNA ligaseIV和Cernummos/XLF）蛋白的辅助下，根据抗原类型的不同特异性的通过经典的非同源末端途径（NHEJ）再连接形成含两基因片段编码序列的连接体和信号序列连接体。 从而使中间一些没有功能活性的碱基折叠成环状后被剪切。
3 RAGs在NK细胞中的生物学功能
长期以来，相关于RAGs在淋巴细胞中的研究报道主要集中在参与适应性免疫反应的B细胞和T细胞。NK细胞作为连接先天免疫和适应性免疫的桥梁，存在许多潜在的发现价值。来源于骨髓淋巴样干细胞的自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）因其能够在适应性免疫应答之前直接杀伤病原微生物，在发育的过程中依赖于种系编码产生抗原受体而一直被分化于先天免疫的范畴。直至2015年7月，Jenny M. Karo及其同事发现并证实了RAGs选择性的表达于NK细胞的个体发育区分功能异质性的过程中。早在20世纪90年代初期Spits H及其同事就提出了T/NK前体细胞假说。2006年，Veinotte及其同事也发现在鼠的外周血中发现了伴有TCRγ受体的NK细胞亚型。前期研究发现NK细胞可以发生类似免疫球蛋白和T细胞基因座的重排，但是这种重排并未产生有功能的抗原受体。这些无功能的抗原受体究竟有无生理学意义仍然还是个未解之谜。最近研究发现，一直被分类在先天免疫系统（固有免疫系统）的NK细胞也有适应性免疫的特征，即RAG参与发育进程。RAG在NK细胞个体发育的过程当中，通过转录水平和表观遗传的变异在NK细胞的外周血中建立有功能的子集，并可通过断裂DNA双链来调节自然杀伤细胞在应对病原微生物侵染时的免疫应答、功能和寿命。用小鼠原基分布图（“fate mapping”mice）發现，在NK细胞的发育过程中，RAG的表达可以增加外周血细胞中NK的免疫作用。2015年，Jenny M. Karo and Joseph C. Sun通過建立NK细胞表达鼠巨细胞病毒（mouse cytomegalovirus MCMV）特异性活化受体Ly49H模型的方式，比较RAG表达的NK细胞与正常的NK细胞在应对病毒侵染时是否能快速增殖，发现RAG1/2缺失的NK细胞在应对病毒入侵时，免疫应答反映明显缺失。此外，在缺失RAG表达的成熟NK细胞中，参与NHEJ过程的酶DNA-PKcs （Prkdc），Ku80 （Xrcc5）， Chk2 （Chek2）和 ATM （Atm）的表达量将明显减少。这说明RAGs或许是在先天免疫系统地成熟过程中一个关键且不可或缺的一类蛋白。为今后免疫学研究人员继续研究工作具有重要意义。
作者简介：
李丽（1991—），女，硕士研究生，主要研究方向为海洋生物制药
[关键词]免疫系统 RAGs V（D）J重组 NK细胞
中图分类号：TU857 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）28-0162-01
抗体对抗原的识别具有特异性。在脊椎动物的基因组中，有效基因的总体数量却是有限的。那么，有颌类脊椎动物是怎样来产生抗体的呢？上世纪80年代，Schatz和Oettinger等免疫学家在有颌类脊椎动物的免疫细胞中发现了与重组多种抗原受体密切相关的重组活化基因（recombination activating gene，RAG）。RAGs包括RAG1和RAG2，是一对在染色体上排列十分紧密的基因，主要在有颌类脊椎动物的淋巴细胞中表达。此外，在斑马鱼的非淋巴组织嗅觉神经元中也发现了RAGs。研究显示有颌类脊椎动物可依赖淋巴细胞表面的RAG来介导V（D）J重组从而产生多种抗体以低于外界病原微生物的入侵。除此之外，Jenny M. Karo及其同事还发现RAG分子在固有免疫自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）中也发挥了非常重要的作用。
1 RAG的基本结构及生物化学功能
目前研究发现来自于小鼠的RAG1分子由1040个氨基酸残基组成，第1至383位的氨基酸残基非核心区和第384至1008位的氨基酸残基核心区组成。位于RAG1核心区第389-422位的氨基酸残基能够形成二聚体与RSS的九聚物结合。重组信号序列RSS是由保守的七聚体（5-CACAGTG-3′）、九聚体（5′-ACAAAAACC-3′）和中间相对不保守的12或23bp的间隔序列形成的重组信号序列（简称12RSS或23RSS）;RAG1通过识别RSS的九聚体介导对DNA上RSS的识别作用，具有攻击双链DNA活性;位于RAG1羧基末端第761-979位的氨基酸残基可以非特异性的结合双链断裂的DNA。RAG1的非核心区含有E3泛素连接酶活性。RAG2由527个氨基酸残基组成，第1至387位的氨基酸残基为核心区、第388-527位的氨基酸残基为非核心区。RAG2的非核心区含有九聚体和锌指等结构域。此外，RAG2 的羧基末端还含有一个同源域指状结构（plant homeodomain finger，PhD）。该结构域含有能够与三甲基化组蛋白（H3K4me3）发生特异性相互作用的位点，对RAG1/2共同行使酶切功能具有重要的调节作用。2015年，Mihai Ciubotaru等人首次解析了大鼠RAG1-RAG2复合物的晶体结构在二维电子显微镜负染色（阴性染色）图像中呈“Y”型，是分子量为230kDa的异四聚体。RAG1二聚体形成“Y”，活性位点位于“Y”中间，RAG2位于“Y”型手臂的尖端。
2 淋巴细胞发育过程中V（D）J 重组发生过程
生物个体的发育要严格的按照组织、细胞的发育阶段进行调控，V（D）J 重组也要如此。淋巴细胞发育主要经历了从祖B 淋巴细胞、前B 淋巴细胞、未成熟B 淋巴细胞至成熟的B 淋巴细胞的过程。V（D） J 重排过程主要发生在淋巴细胞的未成熟阶段。V（D） J 重排主要分为两步：（1）.RSS处位点特异性酶切;（2）.非同源末端连接。在淋巴细胞表面，排列着大量独立的V、D、J基因片段，在这些基因片段的两侧含有12或23标记的RSS，RSS是由富含A、T的九聚体和高保守性的具有回文结构的七聚体及其相对不保守的间隔序列（12或23bp）组成。RSS的七聚物（ heptamer， 5’CACAGTG3’）与基因片段的连接处是RAG1识别的分子标记。RAG1作为生物体内行使“核酸内切酶”功能的基因，其与RAG2结合成复合体后，同高迁移率组蛋白（HMGB1）一起去识别12或23 RSS后起始V（D）J重组。重组遵守12/23规则。RAGs在识别携带12或23RSS的基因片段后，RAGs将DNA双链中一条链“切开”，使其形成单个信号复合体，而后，RAGs-HMGB1复合体快速去识别DNA双链中另一条反向互补DNA链中符合12/23规则的RSS，将其快速切断，双链DNA两侧断裂形成环状发卡结构编码序列。对于不同的抗原，携带不同的RSS标记的基因片段在特异性的核酸内切酶Artemis的帮助下将两侧发卡结构编码序列打开，而后在一些修复蛋白（包括Ku70、Ku80、XRCC4、DNA ligaseIV和Cernummos/XLF）蛋白的辅助下，根据抗原类型的不同特异性的通过经典的非同源末端途径（NHEJ）再连接形成含两基因片段编码序列的连接体和信号序列连接体。 从而使中间一些没有功能活性的碱基折叠成环状后被剪切。
3 RAGs在NK细胞中的生物学功能
长期以来，相关于RAGs在淋巴细胞中的研究报道主要集中在参与适应性免疫反应的B细胞和T细胞。NK细胞作为连接先天免疫和适应性免疫的桥梁，存在许多潜在的发现价值。来源于骨髓淋巴样干细胞的自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）因其能够在适应性免疫应答之前直接杀伤病原微生物，在发育的过程中依赖于种系编码产生抗原受体而一直被分化于先天免疫的范畴。直至2015年7月，Jenny M. Karo及其同事发现并证实了RAGs选择性的表达于NK细胞的个体发育区分功能异质性的过程中。早在20世纪90年代初期Spits H及其同事就提出了T/NK前体细胞假说。2006年，Veinotte及其同事也发现在鼠的外周血中发现了伴有TCRγ受体的NK细胞亚型。前期研究发现NK细胞可以发生类似免疫球蛋白和T细胞基因座的重排，但是这种重排并未产生有功能的抗原受体。这些无功能的抗原受体究竟有无生理学意义仍然还是个未解之谜。最近研究发现，一直被分类在先天免疫系统（固有免疫系统）的NK细胞也有适应性免疫的特征，即RAG参与发育进程。RAG在NK细胞个体发育的过程当中，通过转录水平和表观遗传的变异在NK细胞的外周血中建立有功能的子集，并可通过断裂DNA双链来调节自然杀伤细胞在应对病原微生物侵染时的免疫应答、功能和寿命。用小鼠原基分布图（“fate mapping”mice）發现，在NK细胞的发育过程中，RAG的表达可以增加外周血细胞中NK的免疫作用。2015年，Jenny M. Karo and Joseph C. Sun通過建立NK细胞表达鼠巨细胞病毒（mouse cytomegalovirus MCMV）特异性活化受体Ly49H模型的方式，比较RAG表达的NK细胞与正常的NK细胞在应对病毒侵染时是否能快速增殖，发现RAG1/2缺失的NK细胞在应对病毒入侵时，免疫应答反映明显缺失。此外，在缺失RAG表达的成熟NK细胞中，参与NHEJ过程的酶DNA-PKcs （Prkdc），Ku80 （Xrcc5）， Chk2 （Chek2）和 ATM （Atm）的表达量将明显减少。这说明RAGs或许是在先天免疫系统地成熟过程中一个关键且不可或缺的一类蛋白。为今后免疫学研究人员继续研究工作具有重要意义。
作者简介：
李丽（1991—），女，硕士研究生，主要研究方向为海洋生物制药