论文部分内容阅读
【摘要】 目的 建立了高效液相色谱法(HPLC)检查诺氟沙星口服常释制剂中有关物质的方法。并进一步探讨制剂中有关物质情况。方法 采用C18硅胶色谱柱,以0.025mol/L磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至3.0±0.1)-乙腈(88:12)为流动相A,乙腈为流动相B,进行线性梯度洗脱,检测波长262nm与278nm。结果 对226批样品检测结果表明该方法极大提高了有关物质的检出率。结论 方法简便快速,准确可靠。
【关键词】 高效液相色谱法;检查;诺氟沙星口服常释制剂
考察2010年版《中国药典》中诺氟沙星有关物质检查项,发现其检查方法有较大漏洞,即在满足系统适用性条件下,仍有60%几率使杂质E被包裹在主峰里,造成有关物质测定不准确;且特异性杂质测定有待进一步优化。本文运用高效液相色谱法(HPLC)建立了诺氟沙星口服常释制剂(片剂、胶囊)有关物质的检查方法,简便、快速、准确可靠。
1 仪器与试药
Agilent1200高效液相色谱仪,AG-135电子天平。
诺氟沙星对照品:批号:130450-200705,纯度:99.6%,由中国药品生物制品检定研究院提供。杂质对照品均来源于浙江新东港药业。226批诺氟沙星口服制剂均为2010年国家评价性抽验样品,由181家企业生产,乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。
2 方 法
2.1 色谱条件 0.025mol/L磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至3.0±0.1)-乙腈(88:12)为流动相A,乙腈为流动相B;按下表进行线性梯度洗脱,流速:1.0mL/min。
2.2 供试品溶液 取样品细粉适量,精密称定,加0.1mol/L盐酸溶液适量(每12.5mg诺氟沙星加1ml)使溶解,加流动相A稀释制成每1ml中含0.15mg的溶液,摇匀,滤过,作为供试品溶液。
2.3 对照溶液 精密量取供试品溶液适量,用流动相A制成每1ml含0.15μg的溶液,作为对照溶液。
2.4 杂质对照品溶液 称取杂质A对照品约15mg加适量乙腈溶解后用流动相A稀释制成每1ml约含0.3μg的溶液,作为杂质对照溶液A。称取诺氟沙星对照品、杂质E对照品各适量,加0.1mol/L盐酸溶液适量使溶解,用流动相A稀释制成每1ml溶液中含诺氟沙星0.15mg、杂质E0.3μg的混合溶液,作为杂质对照溶液B。
2.5 系统适用性 取杂质对照溶液B20μl,注入液相色谱仪,以262nm为检测波长,记录色谱图,诺氟沙星与杂质E的分离度应符合规定。
2.6 检验方法 精密量取供试品溶液、对照溶液各20μl,注入液相色谱仪,以278nm和262nm为检测波长,精密量取杂质对照溶液A20μl,注入液相色谱仪,以262nm为检测波长,记录色谱图,采用外标法计算样品中杂质A的含量(262nm),采用自身对照法计算样品中杂质E(262nm),其他杂质(278nm)的含量。
3 方法学验证
3.1 系统适用性 2.5项结果如图1,诺氟沙星与杂质E分离度为2.5,符合规定。
3.2 专属性 分别取诺氟沙星对照品约15mg,分别进行氧化破坏(加入30%过氧化氢溶液5ml,室温放置24小时),强酸破坏(1mol/L的盐酸溶液5ml溶解,室温放置18小时后调pH值至中性),强碱破坏(1mol/L的氢氧化钠溶液5ml,室温放置18小时后调pH值至中性),強光破坏(日照两个月),高温破坏(140℃放置6小时),加流动相稀释至0.15mg/ml,用2.1项下的色谱条件考察。结果表明本品经酸﹑碱﹑氧化、光照破坏后,降解产物峰在本色谱条件下均能与主峰得到较好分离,专属性较好。
3.3 线性、范围、检测限、校正因子、定量方法
3.3.1 诺氟沙星 精密称取诺氟沙星对照品(纯度99.6%,来源于中检所)16.78mg置100ml容量瓶,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取2ml置100ml量瓶,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为溶液(3),精密量取溶液(1)1ml置100ml量瓶,加流动相稀释至刻度,作为溶液(4),分别量取溶液(3)2μl、10μl、20μl,溶液(4)20μl、80μl注入液相色谱仪,记录峰面积。诺氟沙星在0.6685-66.8515ng范围内线性关系良好,在278nm波长处回归方程Y=7.5752X+6.2428,R=0.9999;在262nm波长回归方程为Y=3.4732X+1.7375,R=0.9998。采用16.78mg/ml的对照品溶液,采用连续稀释法进样,测定其检测限约为1ng。
3.3.2 杂质E 精密称取杂质E对照品(纯度98.44%,来源于新东港药业)11.07mg置100ml容量瓶,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取2ml置100ml量瓶,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为溶液(5),分别量取溶液(5)1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl注入液相色谱仪,在262nm波长处测定峰面积。在262nm波长处,杂质E在2.1795-43.5892ng范围内呈线性相关,回归方程Y=3.7619X-0.1231,R=0.9998。相对诺氟沙星响应因子为0.92,可采用主成分自身对照法。
3.3.3 杂质A 精密称取杂质A对照品(纯度98.06%)12.45mg置100ml容量瓶,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取2ml置100ml量瓶,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为溶液(5),精密量取溶液(5)1ml置100ml量瓶,加流动相稀释至刻度,作为溶液(6),分别量取溶液(5)1μl、2μl、5μl、10μl,溶液(6)80μl注入液相色谱仪,记录峰面积。杂质A在1.9534-24.4169ng范围内在262nm波长处呈线性相关,回归方程Y=6.8037X-0.0637,R=0.9997。相对诺氟沙星响应因子0.51,采用杂质对照品法。
3.4 精密度 取“2.3”项下的对照品溶液,分别连续进样6次测定,记录色谱图,以峰面积计算RSD(n=6)为0.1%,结果表明本法的精密度良好。
3.5 重现性 精密称取同一批号的样品,共6份,照2项实验,计算有关物质的杂质总量分别为0.201%,0.201%,0.202%,0.201%,0.202%,0.201%,RSD为0.3%。
4 样品的检查
4.1 检验结果 选取国抽样品226批进行检验,226批次样品中有59%样品杂质A>0.1%,有34%样品杂质E>0.1%,最高达到1.8%,不同批次杂质E含量具有显著性差异,需重点控制,与欧洲药典相符合。
4.2 分别采用本法与2010年版药典方法对226批次样品进行检验,本法不合格率为22.6%,明显高于2010年版药典方法的1.8%,在控制诺氟沙星有关物质上更加准确与严格。
5 讨 论
5.1 检测波长 用DAD检测器对杂质A、E与诺氟沙星进行全波长在线扫描。杂质A最大吸收波长为262nm,杂质E最大吸收波长为253nm与271nm,杂质E在262nm波长处能获得与主峰更好的分离度,故选取262nm为杂质A、E的检测波长。在278nm波长处能检测出最多的杂质数,故选取278nm为其他杂质检查波长。
5.2 该色谱系统对柱子的选择性较大,不同品牌的C18柱子对杂质E与诺氟沙星峰的分离能力不同,所以必须选择满足系统适用性实验要求的色谱柱,以确保可能存在的杂质能够检出。
参考文献
[1] <中国药典>2010年版二部.
[2] EP6.0.
【关键词】 高效液相色谱法;检查;诺氟沙星口服常释制剂
考察2010年版《中国药典》中诺氟沙星有关物质检查项,发现其检查方法有较大漏洞,即在满足系统适用性条件下,仍有60%几率使杂质E被包裹在主峰里,造成有关物质测定不准确;且特异性杂质测定有待进一步优化。本文运用高效液相色谱法(HPLC)建立了诺氟沙星口服常释制剂(片剂、胶囊)有关物质的检查方法,简便、快速、准确可靠。
1 仪器与试药
Agilent1200高效液相色谱仪,AG-135电子天平。
诺氟沙星对照品:批号:130450-200705,纯度:99.6%,由中国药品生物制品检定研究院提供。杂质对照品均来源于浙江新东港药业。226批诺氟沙星口服制剂均为2010年国家评价性抽验样品,由181家企业生产,乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。
2 方 法
2.1 色谱条件 0.025mol/L磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至3.0±0.1)-乙腈(88:12)为流动相A,乙腈为流动相B;按下表进行线性梯度洗脱,流速:1.0mL/min。
2.2 供试品溶液 取样品细粉适量,精密称定,加0.1mol/L盐酸溶液适量(每12.5mg诺氟沙星加1ml)使溶解,加流动相A稀释制成每1ml中含0.15mg的溶液,摇匀,滤过,作为供试品溶液。
2.3 对照溶液 精密量取供试品溶液适量,用流动相A制成每1ml含0.15μg的溶液,作为对照溶液。
2.4 杂质对照品溶液 称取杂质A对照品约15mg加适量乙腈溶解后用流动相A稀释制成每1ml约含0.3μg的溶液,作为杂质对照溶液A。称取诺氟沙星对照品、杂质E对照品各适量,加0.1mol/L盐酸溶液适量使溶解,用流动相A稀释制成每1ml溶液中含诺氟沙星0.15mg、杂质E0.3μg的混合溶液,作为杂质对照溶液B。
2.5 系统适用性 取杂质对照溶液B20μl,注入液相色谱仪,以262nm为检测波长,记录色谱图,诺氟沙星与杂质E的分离度应符合规定。
2.6 检验方法 精密量取供试品溶液、对照溶液各20μl,注入液相色谱仪,以278nm和262nm为检测波长,精密量取杂质对照溶液A20μl,注入液相色谱仪,以262nm为检测波长,记录色谱图,采用外标法计算样品中杂质A的含量(262nm),采用自身对照法计算样品中杂质E(262nm),其他杂质(278nm)的含量。
3 方法学验证
3.1 系统适用性 2.5项结果如图1,诺氟沙星与杂质E分离度为2.5,符合规定。
3.2 专属性 分别取诺氟沙星对照品约15mg,分别进行氧化破坏(加入30%过氧化氢溶液5ml,室温放置24小时),强酸破坏(1mol/L的盐酸溶液5ml溶解,室温放置18小时后调pH值至中性),强碱破坏(1mol/L的氢氧化钠溶液5ml,室温放置18小时后调pH值至中性),強光破坏(日照两个月),高温破坏(140℃放置6小时),加流动相稀释至0.15mg/ml,用2.1项下的色谱条件考察。结果表明本品经酸﹑碱﹑氧化、光照破坏后,降解产物峰在本色谱条件下均能与主峰得到较好分离,专属性较好。
3.3 线性、范围、检测限、校正因子、定量方法
3.3.1 诺氟沙星 精密称取诺氟沙星对照品(纯度99.6%,来源于中检所)16.78mg置100ml容量瓶,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取2ml置100ml量瓶,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为溶液(3),精密量取溶液(1)1ml置100ml量瓶,加流动相稀释至刻度,作为溶液(4),分别量取溶液(3)2μl、10μl、20μl,溶液(4)20μl、80μl注入液相色谱仪,记录峰面积。诺氟沙星在0.6685-66.8515ng范围内线性关系良好,在278nm波长处回归方程Y=7.5752X+6.2428,R=0.9999;在262nm波长回归方程为Y=3.4732X+1.7375,R=0.9998。采用16.78mg/ml的对照品溶液,采用连续稀释法进样,测定其检测限约为1ng。
3.3.2 杂质E 精密称取杂质E对照品(纯度98.44%,来源于新东港药业)11.07mg置100ml容量瓶,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取2ml置100ml量瓶,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为溶液(5),分别量取溶液(5)1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl注入液相色谱仪,在262nm波长处测定峰面积。在262nm波长处,杂质E在2.1795-43.5892ng范围内呈线性相关,回归方程Y=3.7619X-0.1231,R=0.9998。相对诺氟沙星响应因子为0.92,可采用主成分自身对照法。
3.3.3 杂质A 精密称取杂质A对照品(纯度98.06%)12.45mg置100ml容量瓶,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取2ml置100ml量瓶,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为溶液(5),精密量取溶液(5)1ml置100ml量瓶,加流动相稀释至刻度,作为溶液(6),分别量取溶液(5)1μl、2μl、5μl、10μl,溶液(6)80μl注入液相色谱仪,记录峰面积。杂质A在1.9534-24.4169ng范围内在262nm波长处呈线性相关,回归方程Y=6.8037X-0.0637,R=0.9997。相对诺氟沙星响应因子0.51,采用杂质对照品法。
3.4 精密度 取“2.3”项下的对照品溶液,分别连续进样6次测定,记录色谱图,以峰面积计算RSD(n=6)为0.1%,结果表明本法的精密度良好。
3.5 重现性 精密称取同一批号的样品,共6份,照2项实验,计算有关物质的杂质总量分别为0.201%,0.201%,0.202%,0.201%,0.202%,0.201%,RSD为0.3%。
4 样品的检查
4.1 检验结果 选取国抽样品226批进行检验,226批次样品中有59%样品杂质A>0.1%,有34%样品杂质E>0.1%,最高达到1.8%,不同批次杂质E含量具有显著性差异,需重点控制,与欧洲药典相符合。
4.2 分别采用本法与2010年版药典方法对226批次样品进行检验,本法不合格率为22.6%,明显高于2010年版药典方法的1.8%,在控制诺氟沙星有关物质上更加准确与严格。
5 讨 论
5.1 检测波长 用DAD检测器对杂质A、E与诺氟沙星进行全波长在线扫描。杂质A最大吸收波长为262nm,杂质E最大吸收波长为253nm与271nm,杂质E在262nm波长处能获得与主峰更好的分离度,故选取262nm为杂质A、E的检测波长。在278nm波长处能检测出最多的杂质数,故选取278nm为其他杂质检查波长。
5.2 该色谱系统对柱子的选择性较大,不同品牌的C18柱子对杂质E与诺氟沙星峰的分离能力不同,所以必须选择满足系统适用性实验要求的色谱柱,以确保可能存在的杂质能够检出。
参考文献
[1] <中国药典>2010年版二部.
[2] EP6.0.