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【摘要】 目的 建立了高效液相色谱法（HPLC）检查诺氟沙星口服常释制剂中有关物质的方法。并进一步探讨制剂中有关物质情况。方法 采用C18硅胶色谱柱，以0.025mol/L磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至3.0±0.1）-乙腈（88：12）为流动相A，乙腈为流动相B，进行线性梯度洗脱，检测波长262nm与278nm。结果 对226批样品检测结果表明该方法极大提高了有关物质的检出率。结论 方法简便快速，准确可靠。
【关键词】 高效液相色谱法；检查；诺氟沙星口服常释制剂
考察2010年版《中国药典》中诺氟沙星有关物质检查项，发现其检查方法有较大漏洞，即在满足系统适用性条件下，仍有60%几率使杂质E被包裹在主峰里，造成有关物质测定不准确；且特异性杂质测定有待进一步优化。本文运用高效液相色谱法（HPLC）建立了诺氟沙星口服常释制剂（片剂、胶囊）有关物质的检查方法，简便、快速、准确可靠。
1 仪器与试药
Agilent1200高效液相色谱仪，AG-135电子天平。
诺氟沙星对照品：批号：130450-200705，纯度：99.6%，由中国药品生物制品检定研究院提供。杂质对照品均来源于浙江新东港药业。226批诺氟沙星口服制剂均为2010年国家评价性抽验样品，由181家企业生产，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方 法
2.1 色谱条件 0.025mol/L磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至3.0±0.1）-乙腈（88：12）为流动相A，乙腈为流动相B；按下表进行线性梯度洗脱，流速：1.0mL/min。
2.2 供试品溶液 取样品细粉适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液适量（每12.5mg诺氟沙星加1ml）使溶解，加流动相A稀释制成每1ml中含0.15mg的溶液，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
2.3 对照溶液 精密量取供试品溶液适量，用流动相A制成每1ml含0.15μg的溶液，作为对照溶液。
2.4 杂质对照品溶液 称取杂质A对照品约15mg加适量乙腈溶解后用流动相A稀释制成每1ml约含0.3μg的溶液，作为杂质对照溶液A。称取诺氟沙星对照品、杂质E对照品各适量，加0.1mol/L盐酸溶液适量使溶解，用流动相A稀释制成每1ml溶液中含诺氟沙星0.15mg、杂质E0.3μg的混合溶液，作为杂质对照溶液B。
2.5 系统适用性 取杂质对照溶液B20μl，注入液相色谱仪，以262nm为检测波长，记录色谱图，诺氟沙星与杂质E的分离度应符合规定。
2.6 检验方法 精密量取供试品溶液、对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，以278nm和262nm为检测波长，精密量取杂质对照溶液A20μl，注入液相色谱仪，以262nm为检测波长，记录色谱图，采用外标法计算样品中杂质A的含量（262nm），采用自身对照法计算样品中杂质E（262nm），其他杂质（278nm）的含量。
3 方法学验证
3.1 系统适用性 2.5项结果如图1，诺氟沙星与杂质E分离度为2.5，符合规定。
3.2 专属性 分别取诺氟沙星对照品约15mg，分别进行氧化破坏（加入30%过氧化氢溶液5ml，室温放置24小时），强酸破坏（1mol/L的盐酸溶液5ml溶解，室温放置18小时后调pH值至中性），强碱破坏（1mol/L的氢氧化钠溶液5ml，室温放置18小时后调pH值至中性），強光破坏（日照两个月），高温破坏（140℃放置6小时），加流动相稀释至0.15mg/ml，用2.1项下的色谱条件考察。结果表明本品经酸﹑碱﹑氧化、光照破坏后，降解产物峰在本色谱条件下均能与主峰得到较好分离，专属性较好。
3.3 线性、范围、检测限、校正因子、定量方法
3.3.1 诺氟沙星 精密称取诺氟沙星对照品（纯度99.6%，来源于中检所）16.78mg置100ml容量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml置100ml量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为溶液（3），精密量取溶液（1）1ml置100ml量瓶，加流动相稀释至刻度，作为溶液（4），分别量取溶液（3）2μl、10μl、20μl，溶液（4）20μl、80μl注入液相色谱仪，记录峰面积。诺氟沙星在0.6685-66.8515ng范围内线性关系良好，在278nm波长处回归方程Y=7.5752X+6.2428，R=0.9999；在262nm波长回归方程为Y=3.4732X+1.7375，R=0.9998。采用16.78mg/ml的对照品溶液，采用连续稀释法进样，测定其检测限约为1ng。
3.3.2 杂质E 精密称取杂质E对照品（纯度98.44%，来源于新东港药业）11.07mg置100ml容量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml置100ml量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为溶液（5），分别量取溶液（5）1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl注入液相色谱仪，在262nm波长处测定峰面积。在262nm波长处，杂质E在2.1795-43.5892ng范围内呈线性相关，回归方程Y=3.7619X-0.1231，R=0.9998。相对诺氟沙星响应因子为0.92，可采用主成分自身对照法。
3.3.3 杂质A 精密称取杂质A对照品（纯度98.06%）12.45mg置100ml容量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml置100ml量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为溶液（5），精密量取溶液（5）1ml置100ml量瓶，加流动相稀释至刻度，作为溶液（6），分别量取溶液（5）1μl、2μl、5μl、10μl，溶液（6）80μl注入液相色谱仪，记录峰面积。杂质A在1.9534-24.4169ng范围内在262nm波长处呈线性相关，回归方程Y=6.8037X-0.0637，R=0.9997。相对诺氟沙星响应因子0.51，采用杂质对照品法。
3.4 精密度 取“2.3”项下的对照品溶液，分别连续进样6次测定，记录色谱图，以峰面积计算RSD（n=6）为0.1%，结果表明本法的精密度良好。
3.5 重现性 精密称取同一批号的样品，共6份，照2项实验，计算有关物质的杂质总量分别为0.201%，0.201%，0.202%，0.201%，0.202%，0.201%，RSD为0.3%。
4 样品的检查
4.1 检验结果 选取国抽样品226批进行检验，226批次样品中有59%样品杂质A>0.1%，有34%样品杂质E>0.1%，最高达到1.8%，不同批次杂质E含量具有显著性差异，需重点控制，与欧洲药典相符合。
4.2 分别采用本法与2010年版药典方法对226批次样品进行检验，本法不合格率为22.6%，明显高于2010年版药典方法的1.8%，在控制诺氟沙星有关物质上更加准确与严格。
5 讨 论
5.1 检测波长 用DAD检测器对杂质A、E与诺氟沙星进行全波长在线扫描。杂质A最大吸收波长为262nm，杂质E最大吸收波长为253nm与271nm，杂质E在262nm波长处能获得与主峰更好的分离度，故选取262nm为杂质A、E的检测波长。在278nm波长处能检测出最多的杂质数，故选取278nm为其他杂质检查波长。
5.2 该色谱系统对柱子的选择性较大，不同品牌的C18柱子对杂质E与诺氟沙星峰的分离能力不同，所以必须选择满足系统适用性实验要求的色谱柱，以确保可能存在的杂质能够检出。
参考文献
[1] <中国药典>2010年版二部.
[2] EP6.0.
【关键词】 高效液相色谱法；检查；诺氟沙星口服常释制剂
考察2010年版《中国药典》中诺氟沙星有关物质检查项，发现其检查方法有较大漏洞，即在满足系统适用性条件下，仍有60%几率使杂质E被包裹在主峰里，造成有关物质测定不准确；且特异性杂质测定有待进一步优化。本文运用高效液相色谱法（HPLC）建立了诺氟沙星口服常释制剂（片剂、胶囊）有关物质的检查方法，简便、快速、准确可靠。
1 仪器与试药
Agilent1200高效液相色谱仪，AG-135电子天平。
诺氟沙星对照品：批号：130450-200705，纯度：99.6%，由中国药品生物制品检定研究院提供。杂质对照品均来源于浙江新东港药业。226批诺氟沙星口服制剂均为2010年国家评价性抽验样品，由181家企业生产，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方 法
2.1 色谱条件 0.025mol/L磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至3.0±0.1）-乙腈（88：12）为流动相A，乙腈为流动相B；按下表进行线性梯度洗脱，流速：1.0mL/min。
2.2 供试品溶液 取样品细粉适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液适量（每12.5mg诺氟沙星加1ml）使溶解，加流动相A稀释制成每1ml中含0.15mg的溶液，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
2.3 对照溶液 精密量取供试品溶液适量，用流动相A制成每1ml含0.15μg的溶液，作为对照溶液。
2.4 杂质对照品溶液 称取杂质A对照品约15mg加适量乙腈溶解后用流动相A稀释制成每1ml约含0.3μg的溶液，作为杂质对照溶液A。称取诺氟沙星对照品、杂质E对照品各适量，加0.1mol/L盐酸溶液适量使溶解，用流动相A稀释制成每1ml溶液中含诺氟沙星0.15mg、杂质E0.3μg的混合溶液，作为杂质对照溶液B。
2.5 系统适用性 取杂质对照溶液B20μl，注入液相色谱仪，以262nm为检测波长，记录色谱图，诺氟沙星与杂质E的分离度应符合规定。
2.6 检验方法 精密量取供试品溶液、对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，以278nm和262nm为检测波长，精密量取杂质对照溶液A20μl，注入液相色谱仪，以262nm为检测波长，记录色谱图，采用外标法计算样品中杂质A的含量（262nm），采用自身对照法计算样品中杂质E（262nm），其他杂质（278nm）的含量。
3 方法学验证
3.1 系统适用性 2.5项结果如图1，诺氟沙星与杂质E分离度为2.5，符合规定。
3.2 专属性 分别取诺氟沙星对照品约15mg，分别进行氧化破坏（加入30%过氧化氢溶液5ml，室温放置24小时），强酸破坏（1mol/L的盐酸溶液5ml溶解，室温放置18小时后调pH值至中性），强碱破坏（1mol/L的氢氧化钠溶液5ml，室温放置18小时后调pH值至中性），強光破坏（日照两个月），高温破坏（140℃放置6小时），加流动相稀释至0.15mg/ml，用2.1项下的色谱条件考察。结果表明本品经酸﹑碱﹑氧化、光照破坏后，降解产物峰在本色谱条件下均能与主峰得到较好分离，专属性较好。
3.3 线性、范围、检测限、校正因子、定量方法
3.3.1 诺氟沙星 精密称取诺氟沙星对照品（纯度99.6%，来源于中检所）16.78mg置100ml容量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml置100ml量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为溶液（3），精密量取溶液（1）1ml置100ml量瓶，加流动相稀释至刻度，作为溶液（4），分别量取溶液（3）2μl、10μl、20μl，溶液（4）20μl、80μl注入液相色谱仪，记录峰面积。诺氟沙星在0.6685-66.8515ng范围内线性关系良好，在278nm波长处回归方程Y=7.5752X+6.2428，R=0.9999；在262nm波长回归方程为Y=3.4732X+1.7375，R=0.9998。采用16.78mg/ml的对照品溶液，采用连续稀释法进样，测定其检测限约为1ng。
3.3.2 杂质E 精密称取杂质E对照品（纯度98.44%，来源于新东港药业）11.07mg置100ml容量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml置100ml量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为溶液（5），分别量取溶液（5）1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl注入液相色谱仪，在262nm波长处测定峰面积。在262nm波长处，杂质E在2.1795-43.5892ng范围内呈线性相关，回归方程Y=3.7619X-0.1231，R=0.9998。相对诺氟沙星响应因子为0.92，可采用主成分自身对照法。
3.3.3 杂质A 精密称取杂质A对照品（纯度98.06%）12.45mg置100ml容量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml置100ml量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为溶液（5），精密量取溶液（5）1ml置100ml量瓶，加流动相稀释至刻度，作为溶液（6），分别量取溶液（5）1μl、2μl、5μl、10μl，溶液（6）80μl注入液相色谱仪，记录峰面积。杂质A在1.9534-24.4169ng范围内在262nm波长处呈线性相关，回归方程Y=6.8037X-0.0637，R=0.9997。相对诺氟沙星响应因子0.51，采用杂质对照品法。
3.4 精密度 取“2.3”项下的对照品溶液，分别连续进样6次测定，记录色谱图，以峰面积计算RSD（n=6）为0.1%，结果表明本法的精密度良好。
3.5 重现性 精密称取同一批号的样品，共6份，照2项实验，计算有关物质的杂质总量分别为0.201%，0.201%，0.202%，0.201%，0.202%，0.201%，RSD为0.3%。
4 样品的检查
4.1 检验结果 选取国抽样品226批进行检验，226批次样品中有59%样品杂质A>0.1%，有34%样品杂质E>0.1%，最高达到1.8%，不同批次杂质E含量具有显著性差异，需重点控制，与欧洲药典相符合。
4.2 分别采用本法与2010年版药典方法对226批次样品进行检验，本法不合格率为22.6%，明显高于2010年版药典方法的1.8%，在控制诺氟沙星有关物质上更加准确与严格。
5 讨 论
5.1 检测波长 用DAD检测器对杂质A、E与诺氟沙星进行全波长在线扫描。杂质A最大吸收波长为262nm，杂质E最大吸收波长为253nm与271nm，杂质E在262nm波长处能获得与主峰更好的分离度，故选取262nm为杂质A、E的检测波长。在278nm波长处能检测出最多的杂质数，故选取278nm为其他杂质检查波长。
5.2 该色谱系统对柱子的选择性较大，不同品牌的C18柱子对杂质E与诺氟沙星峰的分离能力不同，所以必须选择满足系统适用性实验要求的色谱柱，以确保可能存在的杂质能够检出。
参考文献
[1] <中国药典>2010年版二部.
[2] EP6.0.