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[摘要] 目的 研究胸腺修饰对异种移植免疫排斥反应的影响，探讨Th2细胞的作用。 方法 将供体豚鼠（20只）和受体SD大鼠（20只）随机分成四组，A组（对照组）；B组（胸腺修饰IT组）；C组（CVF组）；D组（IT加CVF组），每组各10只，5只供体豚鼠，5只受体SD大鼠。观测指标：脾脏GATA-3，CCR3变化。 结果 脾脏GATA-3的表达，测得灰度值分别为：A组：80.718±1.650，B组：81.510±1.890，C组：166.160±7.360，D组：115.074±3.090；D组表达较C组弱，差异有统计学意义（P<0.05）。C组的脾脏GATA-3、CCR3免疫组化较D组表达明显增强。 结论 Th2细胞的增殖通过豚鼠MSCs修饰大鼠胸腺被有效抑制，从而使大鼠IgG类诱生异种抗体的产生也受到抑制。
[关键词] 胸腺修饰；异种心脏移植；骨髓间充质干细胞；免疫耐受
[中图分类号] R654.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）20-
目前临床上同种心脏移植术逐渐成为终末期心脏疾病治疗的有效方法，临床治疗上很多患者通过此方法被成功救治，但目前同种心脏移植术的临床推广和应用范围比较小，主要因其自身供体较少，临床供应短缺，导致不能在临床上广泛推广心脏移植手术。异种移植可用其他物种代替人体器官进行移植手术，因动物可以为移植提供无尽的来源，当前的异种移植术值得更广泛研究，提高异种移植的各项技术，可使心脏移植手术大大提高临床的推广和应用。本研究通过大鼠胸腺修饰的思路来进行异种间的分析，以了解Th2细胞的表达情况。
1 材料和方法
1.1 实验试剂
DMEM培养液，胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）；中华眼镜蛇毒因子（CVF，昆明倍捷公司）；Goat Anti Rat GATA-3（美国abCAM公司）；Goat Anti Rat CCR3（武汉博士德公司）。
1.2 手术材料
8-0无创伤缝线（上海浦东金环医疗用品有限公司）；手术显微镜（YZ 20T-Ⅲ型）；二氧化碳培养箱（Heraeus.BB 5060）。
1.3 实验动物
供体选择；20只豚鼠，要求：健康；雄性，体重控制在在400～450 g。受体选择：20只SD雌性大鼠，要求：健康，雌性，体重控制在250～300 g，均为南京中医药大学动物室提供。
1.4 实验方法
1.4.1 全骨髓贴壁筛选法MSCs分离、培养、扩增 三色豚鼠四肢长骨骨髓，取单个核细胞层。待细胞生长达到80%融合时传代。当这些传代细胞完全融合时得到的及为BM-MSCs。
1.4.2 胸腺修饰 大鼠胸腺内注射0.1 mL MSCs（1×105个/0.1 mL/次）。用4号针头缓慢注入，常规结扎穿刺点。
1.4.3 实验分组 各组各取供、受体各5只，对A组（对照组）的5只豚鼠和5只大鼠做异位异种腹腔心脏移植，不对其受体作任何特殊的预处理。对B组（即IT组）进行豚鼠MSCs胸腺修饰受体大鼠，并在第15天后对豚鼠到受体大鼠进行异位异种的腹腔心脏移植。C组（CVF组）在术前24 h仅对受体接受CVF预处理，然后行异种异位移植。D组（CVF+IT组）在受体接受供体MSCs胸腺注射及术前CVF预处理，再行异种异位移植。
1.4.4 建大鼠腹腔异位心脏移植模型 采用改良的Ono′s术式，进行豚鼠心脏在受体大鼠腹腔内异位移植。经主动脉反复将供体心脏血液冲洗干净（肝素生理盐水），将冲洗干净的供体心脏置于冰生理盐水中备用。心脏移植显微血管吻合采用二定点吻合法。
1.4.5 检测大鼠脾脏GATA-3表达水平（Western blot法） 步骤包括：（1）溶液配制；（2）蛋白样品制备；（3）SDS-PAGE凝胶电泳；（4）Western印迹法；（5）免疫显色；（6）结果分析。
1.4.6 脾脏GATA-3、CCR3表达水平的检测 用免疫组化法（SP）法对GATA-3、CCR3蛋白进行免疫组化染色，按说明书染色步骤进行操作，检测其表达水平。
1.5 统计学处理
使用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计并分析，计量资料用（ ±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠脾脏GATA-3表达水平的检测
4组大鼠脾脏GATA-3表达水平（Western blot法）检测结果显示：A、B、C、D 4组细胞总蛋白上样量一致，且β-actin条带的亮度基本相同。平均灰度值测定结果：A、B组中大鼠脾脏GATA-3表达最弱，差异无统计学意义（P>0.05）。C组中的表达明显高于D组，用Quantity One软件定量分析的结果和图4、5中可明显看出，GATA-3表达在D组脾脏中的表达弱于C组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。C、D组分别与A、B组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1、表1。
[关键词] 胸腺修饰；异种心脏移植；骨髓间充质干细胞；免疫耐受
[中图分类号] R654.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）20-
目前临床上同种心脏移植术逐渐成为终末期心脏疾病治疗的有效方法，临床治疗上很多患者通过此方法被成功救治，但目前同种心脏移植术的临床推广和应用范围比较小，主要因其自身供体较少，临床供应短缺，导致不能在临床上广泛推广心脏移植手术。异种移植可用其他物种代替人体器官进行移植手术，因动物可以为移植提供无尽的来源，当前的异种移植术值得更广泛研究，提高异种移植的各项技术，可使心脏移植手术大大提高临床的推广和应用。本研究通过大鼠胸腺修饰的思路来进行异种间的分析，以了解Th2细胞的表达情况。
1 材料和方法
1.1 实验试剂
DMEM培养液，胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）；中华眼镜蛇毒因子（CVF，昆明倍捷公司）；Goat Anti Rat GATA-3（美国abCAM公司）；Goat Anti Rat CCR3（武汉博士德公司）。
1.2 手术材料
8-0无创伤缝线（上海浦东金环医疗用品有限公司）；手术显微镜（YZ 20T-Ⅲ型）；二氧化碳培养箱（Heraeus.BB 5060）。
1.3 实验动物
供体选择；20只豚鼠，要求：健康；雄性，体重控制在在400～450 g。受体选择：20只SD雌性大鼠，要求：健康，雌性，体重控制在250～300 g，均为南京中医药大学动物室提供。
1.4 实验方法
1.4.1 全骨髓贴壁筛选法MSCs分离、培养、扩增 三色豚鼠四肢长骨骨髓，取单个核细胞层。待细胞生长达到80%融合时传代。当这些传代细胞完全融合时得到的及为BM-MSCs。
1.4.2 胸腺修饰 大鼠胸腺内注射0.1 mL MSCs（1×105个/0.1 mL/次）。用4号针头缓慢注入，常规结扎穿刺点。
1.4.3 实验分组 各组各取供、受体各5只，对A组（对照组）的5只豚鼠和5只大鼠做异位异种腹腔心脏移植，不对其受体作任何特殊的预处理。对B组（即IT组）进行豚鼠MSCs胸腺修饰受体大鼠，并在第15天后对豚鼠到受体大鼠进行异位异种的腹腔心脏移植。C组（CVF组）在术前24 h仅对受体接受CVF预处理，然后行异种异位移植。D组（CVF+IT组）在受体接受供体MSCs胸腺注射及术前CVF预处理，再行异种异位移植。
1.4.4 建大鼠腹腔异位心脏移植模型 采用改良的Ono′s术式，进行豚鼠心脏在受体大鼠腹腔内异位移植。经主动脉反复将供体心脏血液冲洗干净（肝素生理盐水），将冲洗干净的供体心脏置于冰生理盐水中备用。心脏移植显微血管吻合采用二定点吻合法。
1.4.5 检测大鼠脾脏GATA-3表达水平（Western blot法） 步骤包括：（1）溶液配制；（2）蛋白样品制备；（3）SDS-PAGE凝胶电泳；（4）Western印迹法；（5）免疫显色；（6）结果分析。
1.4.6 脾脏GATA-3、CCR3表达水平的检测 用免疫组化法（SP）法对GATA-3、CCR3蛋白进行免疫组化染色，按说明书染色步骤进行操作，检测其表达水平。
1.5 统计学处理
使用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计并分析，计量资料用（ ±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠脾脏GATA-3表达水平的检测
4组大鼠脾脏GATA-3表达水平（Western blot法）检测结果显示：A、B、C、D 4组细胞总蛋白上样量一致，且β-actin条带的亮度基本相同。平均灰度值测定结果：A、B组中大鼠脾脏GATA-3表达最弱，差异无统计学意义（P>0.05）。C组中的表达明显高于D组，用Quantity One软件定量分析的结果和图4、5中可明显看出，GATA-3表达在D组脾脏中的表达弱于C组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。C、D组分别与A、B组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1、表1。