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摘要近年来，由苹果锈果类病毒Apple scar skin viroid（ASSVd）引起的苹果花脸病、锈果病在我国一些苹果产区日趋严重，对我国苹果生产和苹果产业发展造成严重危害。为了解ASSVd在我国一些苹果产区的发生和变异情况，采用RTPCR对陕西、山东、山西、河北、北京和黑龙江6个苹果产区的35份苹果样品进行检测，并克隆获得30个分离物的基因组全序列，大小为330～333个核苷酸。分析表明，这些分离物的基因组全序列与GenBank中ASSVd基因组核苷酸序列相似度为96%～100%，在苹果锈果类病毒属的末端保守区及中央保守区保守，在致病区和左端区域有突变，一些分离物的突变位点相同。系统发育分析表明分离物因相同的突变位点而聚类，而与地理来源无关。
关键词 苹果；苹果锈果类病毒；RTPCR；变异分析；系统发育
中图分类号： S 432.41
文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.015
Detection and full nucleotide sequences analysis of Apple scar skin viroid
isolates in some apple producing areas of China
Chen Ranran，Xie Jipeng，Ye Ting，Dong Yunhao，Guo Liyun，Zhou Tao
（Department of Plant Pathology， China Agricultural University， Beijing100193， China）
Abstract
In recent years， dappling， scarring and malformation on apple fruits caused by Apple scar skin viroid （ASSVd） is increasing and seriously affects apple production and apple industry development in China. To understand the occurrence and variations of ASSVd in apple production regions of China， 35 samples were collected from six major apple producing areas including Shaanxi， Shandong， Shanxi， Hebei， Beijing and Heilongjiang provinces. Reverse transcriptionPCR and sequence analysis showed that 30 isolates of ASSVd were obtained with genome sizes of 330-333 nucleotides， which had 96%-100% identities with sequences of ASSVd in GenBank， and had conserved terminal conserved region （TCR） and central conserved region （CCR）. Mutations were found in pathogenic region and terminal left region. Interestingly， same mutation sites were found in some isolates. Phylogenetic analysis showed that these isolates clustered due to mutation sites on ASSVd genome while no relation to geographical origins.
Key words
apple；Apple scar skin viroid；RTPCR；variation analysis；phylogenesis
苹果是我国重要的栽培果树，其栽培面积和产量居世界首位[1]。由病毒和类病毒引起的苹果病害在我国苹果产区发生普遍，已经成为影响苹果产量和质量的重要因素[2]。苹果锈果类病毒Apple scar skin viroid（ASSVd）是马铃薯纺锤块茎类病毒科Pospiviroidae苹果锈果类病毒属Apscarviroid成员[3]。1985年我国学者陈炜等在国内首次报道了ASSVd [4]。1987年Hashimoto等发表了ASSVd的基因组全序列 [3]。ASSVd基因组为一条环状的单链RNA，全长约330个核苷酸[3]，具有5个功能区，形成稳定的杆状或拟杆状的二级结构[5]。有研究发现类病毒的保守区域与复制密切相关[67]，RNA的缺失、插入、替换主要发生在致病区和可变区[8]。关于变异位点对ASSVd致病性的影响尚无明确数据，需进一步研究。目前发现ASSVd可侵染苹果[9]、梨[10]、桃[11]、杏[12]和野樱桃[13]等植物。植株一旦感染ASSVd，终生带毒，果树幼树期不出现病症，结果后病症显现，果实的食用价值和商品价值大为降低。
当前我国苹果产业发展迅速，苗木需求量大，因苗木的调运和无性材料的快繁等因素， ASSVd的发生呈加重趋势，在苹果生产中造成的危害日益严重[2]。为研究ASSVd在我国一些苹果产区的发生和变异情况，本文对采自我国6個苹果产区的35份苹果样品进行检测，克隆得到30个ASSVd分离物的全序列，通过对全序列的比对分析，发现了一些相同的变异位点，为研究ASSVd的变异和进化提供了新的数据。 1材料和方法
1.1苹果样品
2011年-2016年在陕西、山东、山西、河北、北京和黑龙江的苹果产区采集有症状的苹果果实样品和无明显症状的枝条样品，共35份（表1）。样品整理后保存于4℃和-20℃。
1.2方法
1.2.1植物总RNA的提取
取0.1～0.2 g样品（叶片，枝条韧皮部或果皮）用SiO2吸附法[14]进行植物总RNA提取。提取的RNA直接反转录或-80℃保存备用。
1.2.2RTPCR检测
反转录体系为20 μL：2.5 mmol /L dNTPs 1.0 μL、5×MMLV Buffer 4 μL、MMLV（40 U/μL）0.5 μL、RNase inhibitor（40 U/μL）0.5 μL、随机六聚体引物和Oligo（dT）引物各0.5 μL、植物总RNA 3.5 μL，用DEPC水补足至20 μL，42℃水浴反应1 h，产物直接进行PCR或-20℃保存备用。
参照报道的扩增ASSVd全基因组序列的引物（正向引物：5′CCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAGCA3′；反向引物：5′CCTTCGTCGACGACGACAGGTGAG3′）[5]进行PCR。PCR反应体系为25 μL：2.5 mmol /L dNTPs 1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.25 μL，正、反向引物各0.5 μL，反转录产物2.0 μL，用ddH2O补足至25 μL。PCR反应循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，67℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。4℃保存。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
1.2.3PCR产物克隆和测序分析
在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，使用普通DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收纯化。将纯化的PCR产物连接至克隆载体pMD19T（simple）上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选单菌落于800 μL含氨芐青霉素（50 μg/mL）的 LB培养基中培养，通过菌液PCR验证鉴定重组质粒，每个样品筛选3个阳性菌液送至北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定。
1.2.4序列比对和系统进化分析
用DNAMAN软件对所得基因序列进行分析。通过BLAST（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）比对分析目的片段。序列对比运用DNAMAN软件和Multalin在线软件[15]进行，以GenBank中ASSVd标准序列（NC_001340.1）为对比序列。进化树构建运用ClustalX和MEGA 6.06的邻接法（neighborjoining）进行，重复次数为1 000，以GenBank中ASBVd（NC_001410）、PSTVd（NC_002030）和ADFVd（NC_003463.1）标准序列作为外组对照，其中ASBVd作为不同科的外组对照，PSTVd作为不同属的外组对照，ADFVd作为同属的外组对照。
2结果与分析
2.1ASSVd检测结果
RTPCR检测结果表明，从采自陕西的4份样品（sxqy1，sxqy2，xa1和xa4），采自山东的8份样品（qd1，qd2，yt1，qd3，qd4，qd6，qd7和qd8），采自河北的5份样品（hb3，hb6，hb7，hb8和hb12），采自北京的3份样品（shz21，cp1和cp2）和采自黑龙江的10份样品（mdj2，mdj11，mdj12，mdj13，59202，59203，59208，59210，59220，59222）中均检测到330 bp左右的特异片段，与ASSVd阳性对照样品检出的条带一致，表明样品被ASSVd侵染。ASSVd的检测结果如表2所示。
2.2ASSVd分离物序列测定与变异分析
将30个样品的PCR产物克隆测序，结果表明所有片段的长度均为330～333 nt。序列比对结果表明，扩增得到的30个片段与GenBank中ASSVd基因组核苷酸序列一致性为96%～100%，表明这些片段均为ASSVd基因组序列。其中样品xa1，xa4，mdj2，mdj11和 mdj12扩增获得的ASSVd序列与登录号为AF421195.1的核苷酸序列一致性均为100%；样品cp1，cp2和shz21扩增得到的ASSVd序列与登录号为AY972082.1的核苷酸序列一致性分别为100%，99%和98%；样品qd1，qd2，hb6，hb7和hb8扩增获得的ASSVd序列与登录号为HQ326093.1的核苷酸序列一致性均为99%；样品qd3，qd7，59202，59208，59210，59220，qd8和qd4扩增得到的ASSVd序列与登录号为KC110860.1的核苷酸序列一致性分别为99%，99%，99%，99%，99%，99%，98%和96%；样品59203扩增出的ASSVd序列与登录号为HQ840722.1的核苷酸序列一致性为98%；从样品yt1扩增出的ASSVd序列与登录号为KC110858.1的核苷酸序列一致性为97%；从样品mdj13，59222和qd6扩增出的ASSVd序列与登录号为KU507023.1的核苷酸序列一致性分别为99%，98%和96%；从样品hb3，hb12，sxqy1和sxqy2扩增出的ASSVd序列与登录号为KP765428.1的核苷酸序列一致性分别为98%，98%，97%和97%。以样品编号命名上述ASSVd分离物。
以GenBank中ASSVd标准序列（NC_001340.1）为对比序列，运用Multalin在线软件比对所有30个分离物的基因组序列，结果如图1所示。所有30条序列及ASSVd标准序列（NC_001340.1）在苹果锈果类病毒属的末端保守区（TCR）及中央保守区（CCR）两个保守区保守，只有qd6分离物在第12位有TA突变。变异位点集中在致病区（P区）与左末端区（TLR）交界处。进一步分析不同分离物的序列，发现分离物xa1，xa4，sxqy1，sxqy2，qd1，qd2，hb3，hb6，hb7，hb8，hb12，cp1，cp2，shz21，mdj2，mdj11和mdj12与参考序列一致性较高；分离物yt1，qd3，qd4，qd6，qd7，qd8，mdj13，50902，50903，50908，50910，50920和50922在第39位存在CA突变，第251位存在GA突变，第261位和第262位插入T碱基，第267位存在GA突变，第290位存在GT突变，第291位存在AG突变。 2.3系统进化分析
进化树分析结果如图2所示。
30个分离物按突变位点的不同聚为2组，聚集与地理来源无关。与ASSVd参考序列一致性高的分离物xa1，xa4，sxqy1，sxqy2，qd1，qd2，hb3，hb6，hb7，hb8，hb12，cp1，cp2，shz21，mdj2，mdj11和mdj12聚为一组；分离物yt1，qd3，qd4，qd6，qd7，qd8，mdj13，50902，50903，50908，50910，50920和50922聚为一组。这些组与外组对照分区明显。
3讨论
近年来，ASSVd在我国苹果产区的发生率逐年增加，若不及时、正确地防控，将对我国苹果产业造成严重危害。本研究采集我国6个苹果产区的疑似被ASSVd侵染的苹果果实样品和一些无症状的枝条样品35份，利用RTPCR方法进行ASSVd检测，结果表明，采自陕西、山东、河北、北京及黑龙江的苹果样品检测到ASSVd，样品的阳性检出率为88.9%～100%。这些数据表明我国一些苹果产区有ASSVd发生。将来的工作将在更广地区采集更多样品进一步调查我国苹果产区的ASSVd发生情况。
本研究成功克隆了30个ASSVd分离物的基因组全序列，序列比对结果表明这些序列含有相同的保守区域（CCR和TCR）。变异位点集中在致病区域和可变区域，这与之前的研究发现类病毒RNA的缺失、插入、替换主要发生在致病区和可变区的结果一致[8]。关于变异位点对ASSVd致病性的影响尚无明确数据，需进一步研究。进化树分析表明所有30条ASSVd序列聚集成两组，并且分离物因相同的变异位点而分组聚类。变异位点分析表明来自同一品种的分离物亦无特异性变异，同一地理来源的分离物无特异性变异，其中黑龙江的‘山丁子’样品和山东部分样品存在相同的变异位点，推测这可能与苗木的调运和接穗的随意嫁接有关。
鉴于ASSVd的发生对我国苹果生产造成严重危害，并有逐年加重的趋势，应及时采取防控措施，切断ASSVd传播源头，尽早更换病树。ASSVd的传播途径主要有种子[16]、带毒枝条嫁接以及修剪工具导致的污染传播[17]。因为目前无有效的防治药剂，因此防控ASSVd的根本措施应以预防为主，选用无毒苗木。
参考文献
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[17]白海霞，高彦，贾少武，等.选用苹果无毒苗木防控病毒病危害[J].西北园艺（果树），2015（3）：1315.
（责任编辑：杨明丽）
关键词 苹果；苹果锈果类病毒；RTPCR；变异分析；系统发育
中图分类号： S 432.41
文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.015
Detection and full nucleotide sequences analysis of Apple scar skin viroid
isolates in some apple producing areas of China
Chen Ranran，Xie Jipeng，Ye Ting，Dong Yunhao，Guo Liyun，Zhou Tao
（Department of Plant Pathology， China Agricultural University， Beijing100193， China）
Abstract
In recent years， dappling， scarring and malformation on apple fruits caused by Apple scar skin viroid （ASSVd） is increasing and seriously affects apple production and apple industry development in China. To understand the occurrence and variations of ASSVd in apple production regions of China， 35 samples were collected from six major apple producing areas including Shaanxi， Shandong， Shanxi， Hebei， Beijing and Heilongjiang provinces. Reverse transcriptionPCR and sequence analysis showed that 30 isolates of ASSVd were obtained with genome sizes of 330-333 nucleotides， which had 96%-100% identities with sequences of ASSVd in GenBank， and had conserved terminal conserved region （TCR） and central conserved region （CCR）. Mutations were found in pathogenic region and terminal left region. Interestingly， same mutation sites were found in some isolates. Phylogenetic analysis showed that these isolates clustered due to mutation sites on ASSVd genome while no relation to geographical origins.
Key words
apple；Apple scar skin viroid；RTPCR；variation analysis；phylogenesis
苹果是我国重要的栽培果树，其栽培面积和产量居世界首位[1]。由病毒和类病毒引起的苹果病害在我国苹果产区发生普遍，已经成为影响苹果产量和质量的重要因素[2]。苹果锈果类病毒Apple scar skin viroid（ASSVd）是马铃薯纺锤块茎类病毒科Pospiviroidae苹果锈果类病毒属Apscarviroid成员[3]。1985年我国学者陈炜等在国内首次报道了ASSVd [4]。1987年Hashimoto等发表了ASSVd的基因组全序列 [3]。ASSVd基因组为一条环状的单链RNA，全长约330个核苷酸[3]，具有5个功能区，形成稳定的杆状或拟杆状的二级结构[5]。有研究发现类病毒的保守区域与复制密切相关[67]，RNA的缺失、插入、替换主要发生在致病区和可变区[8]。关于变异位点对ASSVd致病性的影响尚无明确数据，需进一步研究。目前发现ASSVd可侵染苹果[9]、梨[10]、桃[11]、杏[12]和野樱桃[13]等植物。植株一旦感染ASSVd，终生带毒，果树幼树期不出现病症，结果后病症显现，果实的食用价值和商品价值大为降低。
当前我国苹果产业发展迅速，苗木需求量大，因苗木的调运和无性材料的快繁等因素， ASSVd的发生呈加重趋势，在苹果生产中造成的危害日益严重[2]。为研究ASSVd在我国一些苹果产区的发生和变异情况，本文对采自我国6個苹果产区的35份苹果样品进行检测，克隆得到30个ASSVd分离物的全序列，通过对全序列的比对分析，发现了一些相同的变异位点，为研究ASSVd的变异和进化提供了新的数据。 1材料和方法
1.1苹果样品
2011年-2016年在陕西、山东、山西、河北、北京和黑龙江的苹果产区采集有症状的苹果果实样品和无明显症状的枝条样品，共35份（表1）。样品整理后保存于4℃和-20℃。
1.2方法
1.2.1植物总RNA的提取
取0.1～0.2 g样品（叶片，枝条韧皮部或果皮）用SiO2吸附法[14]进行植物总RNA提取。提取的RNA直接反转录或-80℃保存备用。
1.2.2RTPCR检测
反转录体系为20 μL：2.5 mmol /L dNTPs 1.0 μL、5×MMLV Buffer 4 μL、MMLV（40 U/μL）0.5 μL、RNase inhibitor（40 U/μL）0.5 μL、随机六聚体引物和Oligo（dT）引物各0.5 μL、植物总RNA 3.5 μL，用DEPC水补足至20 μL，42℃水浴反应1 h，产物直接进行PCR或-20℃保存备用。
参照报道的扩增ASSVd全基因组序列的引物（正向引物：5′CCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAGCA3′；反向引物：5′CCTTCGTCGACGACGACAGGTGAG3′）[5]进行PCR。PCR反应体系为25 μL：2.5 mmol /L dNTPs 1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.25 μL，正、反向引物各0.5 μL，反转录产物2.0 μL，用ddH2O补足至25 μL。PCR反应循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，67℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。4℃保存。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
1.2.3PCR产物克隆和测序分析
在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，使用普通DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收纯化。将纯化的PCR产物连接至克隆载体pMD19T（simple）上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选单菌落于800 μL含氨芐青霉素（50 μg/mL）的 LB培养基中培养，通过菌液PCR验证鉴定重组质粒，每个样品筛选3个阳性菌液送至北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定。
1.2.4序列比对和系统进化分析
用DNAMAN软件对所得基因序列进行分析。通过BLAST（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）比对分析目的片段。序列对比运用DNAMAN软件和Multalin在线软件[15]进行，以GenBank中ASSVd标准序列（NC_001340.1）为对比序列。进化树构建运用ClustalX和MEGA 6.06的邻接法（neighborjoining）进行，重复次数为1 000，以GenBank中ASBVd（NC_001410）、PSTVd（NC_002030）和ADFVd（NC_003463.1）标准序列作为外组对照，其中ASBVd作为不同科的外组对照，PSTVd作为不同属的外组对照，ADFVd作为同属的外组对照。
2结果与分析
2.1ASSVd检测结果
RTPCR检测结果表明，从采自陕西的4份样品（sxqy1，sxqy2，xa1和xa4），采自山东的8份样品（qd1，qd2，yt1，qd3，qd4，qd6，qd7和qd8），采自河北的5份样品（hb3，hb6，hb7，hb8和hb12），采自北京的3份样品（shz21，cp1和cp2）和采自黑龙江的10份样品（mdj2，mdj11，mdj12，mdj13，59202，59203，59208，59210，59220，59222）中均检测到330 bp左右的特异片段，与ASSVd阳性对照样品检出的条带一致，表明样品被ASSVd侵染。ASSVd的检测结果如表2所示。
2.2ASSVd分离物序列测定与变异分析
将30个样品的PCR产物克隆测序，结果表明所有片段的长度均为330～333 nt。序列比对结果表明，扩增得到的30个片段与GenBank中ASSVd基因组核苷酸序列一致性为96%～100%，表明这些片段均为ASSVd基因组序列。其中样品xa1，xa4，mdj2，mdj11和 mdj12扩增获得的ASSVd序列与登录号为AF421195.1的核苷酸序列一致性均为100%；样品cp1，cp2和shz21扩增得到的ASSVd序列与登录号为AY972082.1的核苷酸序列一致性分别为100%，99%和98%；样品qd1，qd2，hb6，hb7和hb8扩增获得的ASSVd序列与登录号为HQ326093.1的核苷酸序列一致性均为99%；样品qd3，qd7，59202，59208，59210，59220，qd8和qd4扩增得到的ASSVd序列与登录号为KC110860.1的核苷酸序列一致性分别为99%，99%，99%，99%，99%，99%，98%和96%；样品59203扩增出的ASSVd序列与登录号为HQ840722.1的核苷酸序列一致性为98%；从样品yt1扩增出的ASSVd序列与登录号为KC110858.1的核苷酸序列一致性为97%；从样品mdj13，59222和qd6扩增出的ASSVd序列与登录号为KU507023.1的核苷酸序列一致性分别为99%，98%和96%；从样品hb3，hb12，sxqy1和sxqy2扩增出的ASSVd序列与登录号为KP765428.1的核苷酸序列一致性分别为98%，98%，97%和97%。以样品编号命名上述ASSVd分离物。
以GenBank中ASSVd标准序列（NC_001340.1）为对比序列，运用Multalin在线软件比对所有30个分离物的基因组序列，结果如图1所示。所有30条序列及ASSVd标准序列（NC_001340.1）在苹果锈果类病毒属的末端保守区（TCR）及中央保守区（CCR）两个保守区保守，只有qd6分离物在第12位有TA突变。变异位点集中在致病区（P区）与左末端区（TLR）交界处。进一步分析不同分离物的序列，发现分离物xa1，xa4，sxqy1，sxqy2，qd1，qd2，hb3，hb6，hb7，hb8，hb12，cp1，cp2，shz21，mdj2，mdj11和mdj12与参考序列一致性较高；分离物yt1，qd3，qd4，qd6，qd7，qd8，mdj13，50902，50903，50908，50910，50920和50922在第39位存在CA突变，第251位存在GA突变，第261位和第262位插入T碱基，第267位存在GA突变，第290位存在GT突变，第291位存在AG突变。 2.3系统进化分析
进化树分析结果如图2所示。
30个分离物按突变位点的不同聚为2组，聚集与地理来源无关。与ASSVd参考序列一致性高的分离物xa1，xa4，sxqy1，sxqy2，qd1，qd2，hb3，hb6，hb7，hb8，hb12，cp1，cp2，shz21，mdj2，mdj11和mdj12聚为一组；分离物yt1，qd3，qd4，qd6，qd7，qd8，mdj13，50902，50903，50908，50910，50920和50922聚为一组。这些组与外组对照分区明显。
3讨论
近年来，ASSVd在我国苹果产区的发生率逐年增加，若不及时、正确地防控，将对我国苹果产业造成严重危害。本研究采集我国6个苹果产区的疑似被ASSVd侵染的苹果果实样品和一些无症状的枝条样品35份，利用RTPCR方法进行ASSVd检测，结果表明，采自陕西、山东、河北、北京及黑龙江的苹果样品检测到ASSVd，样品的阳性检出率为88.9%～100%。这些数据表明我国一些苹果产区有ASSVd发生。将来的工作将在更广地区采集更多样品进一步调查我国苹果产区的ASSVd发生情况。
本研究成功克隆了30个ASSVd分离物的基因组全序列，序列比对结果表明这些序列含有相同的保守区域（CCR和TCR）。变异位点集中在致病区域和可变区域，这与之前的研究发现类病毒RNA的缺失、插入、替换主要发生在致病区和可变区的结果一致[8]。关于变异位点对ASSVd致病性的影响尚无明确数据，需进一步研究。进化树分析表明所有30条ASSVd序列聚集成两组，并且分离物因相同的变异位点而分组聚类。变异位点分析表明来自同一品种的分离物亦无特异性变异，同一地理来源的分离物无特异性变异，其中黑龙江的‘山丁子’样品和山东部分样品存在相同的变异位点，推测这可能与苗木的调运和接穗的随意嫁接有关。
鉴于ASSVd的发生对我国苹果生产造成严重危害，并有逐年加重的趋势，应及时采取防控措施，切断ASSVd传播源头，尽早更换病树。ASSVd的传播途径主要有种子[16]、带毒枝条嫁接以及修剪工具导致的污染传播[17]。因为目前无有效的防治药剂，因此防控ASSVd的根本措施应以预防为主，选用无毒苗木。
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（责任编辑：杨明丽）