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摘要:目的:建立SD大鼠运动预处理模型和一次性力竭运动模型,通过观察大鼠大脑皮质微结构、超微结构的变化以及指标测试,探讨运动预处理对一次性力竭后大脑皮质缺血再灌注的保护机制,为科学地进行运动训练提供神经生物学参考依据。方法:选用雄性4月龄SD大鼠70只,适应性喂养1周后随机分为:空白对照组(C组),一次性力竭组(E组)和运动预处理组(EP组),C组、E组大鼠常规喂养6周,EP组采用间歇训练法运动预处理6周。6周后除C组外,其余组大鼠采用一次性力竭训练,并分别在即刻、24小时、48小时取材。测定大鼠脑组织SOD、GSH-PX、MDA;制作切片观察不同时间各组脑组织微结构和超微结构变化。结果:①自由基检测结果:各时相点大鼠脑组织EP组SOD,GSH-PX活性均显著性高于C组和E组(P<0.05);其中EP组在即刻较其它组出现非常显著性(P<0.01),而在第2个时相点E组和EP组均出现非常显著性下降(P<0.01),在第3个时相点出现显著性上升(P<0.05);E组和EP组之间MDA含量没有显著性差(P>0.05),但是E组MDA含量却高于EP组②大鼠大脑皮质微结构和超微结构结果:EP组各时相点神经元细胞核损伤、线粒体损伤均明显好于E组。结论:运动预处理可提高力竭运动后大脑组织SOD、GSH- PX活性,减轻脂质过氧化程度,提高大脑清除自由基能力,从而有效预防一次性力竭运动造成的脑缺血再灌注损伤,起到对机体的内源性保护作用。
关键词:大脑皮质;力竭运动;自由基;超微结构;运动预处理
中图分类号:G804.7 文献标识码:A 文章编号:1006-2076(2012)05-0055-07
在力竭运动时,脑代谢的速率增加,而血供一时得不到满足,这就造成了脑的局部缺血缺氧,此后机体经过短时间的调整,对脑组织的供血增加,这相当于一个再灌注过程。这相当于以运动作为预处理方式,与经典的缺血预处理极为相似。目前,运动预处理实验研究是当前体育科学研究中的重要课题,但是现有的研究成果大部分都集中于心肌、骨骼肌,而对于大脑皮质缺血再灌注损伤的干预研究则不多见。
因此本实验在前人的研究基础上构建“一次性力竭运动”和“运动预处理”模型,观察大鼠脑组织自由基代谢的动态变化和微结构、超微结构的动态变化,探讨运动预处理对力竭运动后自由基代谢的影响,以及运动预处理对缺血再灌注损伤保护的可能机制,为运动性中枢疲劳的研究提供客观依据。
1 实验方法
1.1 实验对象
其余各组大鼠最后一次训练后,在相应时相点按上述方法进行取材。
1.3.2 大脑皮质组织匀浆制备
各组其余8只大鼠,用同样的方法快速将大脑皮质取出,制备组织匀浆,取上清液,以备检测总SOD,MDA,GSH-PX和组织脑蛋白含量。上述操作都控制在冰水混合物上操作,检测样本均贮存于-70℃冰箱中。
试剂和材料:自由基相关数据采用南京建成生物工程研究所试剂盒,并严格按照试剂盒要求进行操作,指标测试在四川大学华西医学院病理实验室完成,测试仪为biotek uquant gene company limited 酶标仪。
1.4 数据处理
3 实验结果分析与讨论
3.1 自由基测试结果
试验结果显示:E1组、E3组、IEP1组、IEP3组大鼠大脑皮质MDA含量较C组都有非常显著性升高,而一次性力竭组和预处理组之间MDA含量没有显著性差异(P>0.05),提示一次性力竭运动均会造成脑自由基堆积。在即刻自由基损伤最为严重,48小时有一定程度的恢复,表明这种损伤是可逆的。此外SOD、GSH-PX活性IEP1组呈非常显著性上升(P<0.01),而E1组无显著性变化(P>0.05);在24 h都呈非常显著性下降趋势(P<0.01),在48小时都有所回升,在这个阶段以GSH-PX上升为主。较E组各时段SOD、GSH-PX活性,IEP组均明显高于E组,说明间歇训练可以有效的提高脑组织清除自由基能力。
本实验选择间歇训练作为预处理方式,训练时大鼠负重为自身体重的6%,依照McArdle的方法推算,其需氧量可增至安静时的4~5倍以上,属于高强度间歇训练[1]。由于强度较大,训练时机体可以形成短暂的缺血缺氧,休息时出现短暂的再灌注现象。从大鼠在水中挣扎情况来看,此次实验强度已达到高强度要求,且大鼠通过一段时间的适应也可完成训练计划。通过体重监测IEP组大鼠体重较E组、C组无显著性差异。此外,平时训练过程中通过观察,发现IEP组大鼠进食、排便情况较E组大鼠更为良好,IEP组大鼠除在第一周适应性游泳时偶尔出现焦躁、乱窜外,此后几周训练都显得较为轻松,出水后都能通过大幅度抖动来甩干体毛,所以,此次实验预处理组所采用的训练模式并未对机体造成疲劳堆积。
3.2 大脑皮质微结构的动态变化
脑作为人体最高调节中枢,其微循环是保证脑完成其调节功能的重要保障。因此本次实验选择大鼠最高调节中枢大脑作为观察对象,对其微结构和超微结构进行跟踪观察发现:1)E1组大鼠微结构观察结果:细胞形态完整,细胞间质均匀致密,可辨认出细胞核;E2组大鼠大脑皮质神经元细胞排列紊乱,多数细胞间质疏松,血管扩张明显,显示脑内出现水肿。E3组大鼠神经元细胞排列紊乱,细胞间质疏松,神经纤维间隙增大,显示脑内有水肿,但是较24 h微结构已有明显好转。2)超微结构观察结果:E1组核膜内陷,溶酶体数量增加线粒体轻微肿胀;E2组胞浆变空,核膜不完整,染色质边聚明显;E3组核膜,核仁内陷,核内出现假包含体,染色质边聚,胞浆内有空泡但是较24 h有明显好转。脑微循环改变将严重影响到脑的功能[3]。在试验中,我们可以发现当脑的微结构损伤时,相应时间段的大脑皮质MDA含量也呈上升趋势,提示:结构的损伤与MDA堆积呈正相关。
运动预处理组微结构的动态改变结果:1)IEP1组大鼠大脑皮质细胞形态完整,细胞间质均匀致密,可辨认出细胞核; IEP2组细胞形态完整,细胞间质均匀致密,细胞核清晰可见;IEP3组虽有部分细胞间见到小空泡但是仍属正常。比较E组微结构改变,一次性力竭对于IEP组造成的损伤显然小得多。2)超微结构结果:IEP1组线粒体轻微肿胀,染色质轻微边聚,但是较C组变化不大,IEP2组核膜内陷,线粒体肿胀提示这一时期脑内可能出现水肿,但是较E2组损伤程度较小。IEP3组大脑皮质线粒体轻微肿胀,血管内皮细胞凹陷,但较正常组并无太大区别,说明机体形态结构上已基本恢复。通过大脑皮质形态结构的动态改变,可以说明:间歇训练作为运动预处理方式可以有效的减轻一次性力竭运动对大脑皮质的损伤。 3.3 间歇训练对大脑皮质缺血再灌注损伤产生保护的可能机制
3.3.1 保证线粒体形态结构的完整性
彭峰林对间歇性低氧训练后大鼠心肌结构进行观察发现间歇低氧适应后能够减轻因低氧引起的心肌线粒体肿胀、线粒体嵴断裂消失,较好的维持线粒体等的正常形态和结构[4]。本次实验电镜观察发现经过预处理训练后的大脑皮质神经元细胞线粒体在遭受缺血再灌注损伤时期形态结构较E组更为完整,特别是在力竭运动后24 h,其差异最为明显。所以推测IEP组大鼠经过6周间歇训练刺激,机体已经对短暂的缺血缺氧产生了适应性,因此,脑结构观察发现IEP1组与C组并无显著差异。24 h时机体遭受再灌注损伤,但是由于之前反复的低氧刺激,IEP2组损伤程度较E2组明显减轻,这可能也是因为IEP组线粒体结构更为完整,使机体能量供应不至于出现代谢障碍,从而机体可以更快更好的清除活性氧,对机体起到保护作用。
3.3.2 增强机体清除自由基能力
本实验为大强度间歇训练,每一次训练机体都处于较强的氧化应激态中,氧自由基的增加可以通过分子机制诱导抗氧化酶发生适应性变化,长期间歇训练,机体处于脉冲式的氧化应激状态中,并通过这种遗传程序诱导增强抗氧化酶的表达,从而实现与有毒的自由基相对抗,对机体进行自我保护。也可能是因为机体在长期的大强度间歇训练中机体产生了低浓度的自由基堆积,进而更大程度地激活了机体抗氧化系统的活力。这也可能是本次实验观察到48小时时机体SOD、GSH-PX仍升高的可能机制。以前也有实验证明低水平的自由基可以促进SOD、GSH-PX等的合成[5]。
3.3.3 增加脑血管微循环能力
彭峰林对间歇性低氧训练后大鼠心肌毛细血管结构进行观察发现间歇运动训练后,毛细血管结构完整,内皮细胞内小泡有所增加,细胞连接无松弛基底膜完整,可见粗面内质网等细胞器。提示间歇低氧和运动适应能使毛细血管密度增加,表明氧运输能力提高了[6]微循环的正常进行对于大脑皮质抗击缺血再灌注损伤有着非常重要的意义,通过大脑皮质形态结构的观察可以发现IEP各组脑血管损伤均较E组有非常显著性减轻。这是因为经过长期的运动预处理,使得大脑皮质毛细血管产生了适应性改变,增加了其获取氧的能力。说明运动预处理对机体摄氧能力的提高不仅仅存在于心肌,在脑内也有同样的适应性改变。
4 结论与建议
4.1 高强度间歇训练作为预处理方式可以有效的保护大脑免受缺血再灌注损伤。
4.2 一次性力竭运动造成的缺血再灌注损伤是可逆的,这种损伤恢复一般要持续到一次性力竭训练后48小时之后。
参考文献:
[1]郑兵,苏全生,熊若虹,等.间歇训练对负荷游泳力竭运动后即刻及恢复期大鼠心肌脂质过氧化及钙离子代谢的影响[J].成都体育学院学报, 2007, 33(5): 92-95.
[2]张梅, 何叶.不同强度运动训练对大鼠海马CA1 区神经元凋亡的影响[J].天津体育学院学报,2006,21(6):151-153.
[3]袁琼嘉,熊若虹,苏全生,等.力竭游泳后大鼠大脑微循环超微结构与自由基代谢动态变化的同步研究[J].生物医学工程学杂志,2006,23(2)∶322-325.
[4]彭峰林,陈建文,邓树勋,等.间歇运动训练对心脏缺血再灌注损伤大鼠心肌抗氧化酶的影响[J].中国运动医学杂志,2008,27(1):97-99.
[5]Dempsey EC, Newton AC, Mochly-Rosen D, et al. Protein kinase C isozymes and the regulation of diverse cell responses[J]. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol ,2000,279(3):L429-L438.
[6]彭峰林.间歇训练对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制的研究[D]//广州:华南师范大学,2007:104.
关键词:大脑皮质;力竭运动;自由基;超微结构;运动预处理
中图分类号:G804.7 文献标识码:A 文章编号:1006-2076(2012)05-0055-07
在力竭运动时,脑代谢的速率增加,而血供一时得不到满足,这就造成了脑的局部缺血缺氧,此后机体经过短时间的调整,对脑组织的供血增加,这相当于一个再灌注过程。这相当于以运动作为预处理方式,与经典的缺血预处理极为相似。目前,运动预处理实验研究是当前体育科学研究中的重要课题,但是现有的研究成果大部分都集中于心肌、骨骼肌,而对于大脑皮质缺血再灌注损伤的干预研究则不多见。
因此本实验在前人的研究基础上构建“一次性力竭运动”和“运动预处理”模型,观察大鼠脑组织自由基代谢的动态变化和微结构、超微结构的动态变化,探讨运动预处理对力竭运动后自由基代谢的影响,以及运动预处理对缺血再灌注损伤保护的可能机制,为运动性中枢疲劳的研究提供客观依据。
1 实验方法
1.1 实验对象
其余各组大鼠最后一次训练后,在相应时相点按上述方法进行取材。
1.3.2 大脑皮质组织匀浆制备
各组其余8只大鼠,用同样的方法快速将大脑皮质取出,制备组织匀浆,取上清液,以备检测总SOD,MDA,GSH-PX和组织脑蛋白含量。上述操作都控制在冰水混合物上操作,检测样本均贮存于-70℃冰箱中。
试剂和材料:自由基相关数据采用南京建成生物工程研究所试剂盒,并严格按照试剂盒要求进行操作,指标测试在四川大学华西医学院病理实验室完成,测试仪为biotek uquant gene company limited 酶标仪。
1.4 数据处理
3 实验结果分析与讨论
3.1 自由基测试结果
试验结果显示:E1组、E3组、IEP1组、IEP3组大鼠大脑皮质MDA含量较C组都有非常显著性升高,而一次性力竭组和预处理组之间MDA含量没有显著性差异(P>0.05),提示一次性力竭运动均会造成脑自由基堆积。在即刻自由基损伤最为严重,48小时有一定程度的恢复,表明这种损伤是可逆的。此外SOD、GSH-PX活性IEP1组呈非常显著性上升(P<0.01),而E1组无显著性变化(P>0.05);在24 h都呈非常显著性下降趋势(P<0.01),在48小时都有所回升,在这个阶段以GSH-PX上升为主。较E组各时段SOD、GSH-PX活性,IEP组均明显高于E组,说明间歇训练可以有效的提高脑组织清除自由基能力。
本实验选择间歇训练作为预处理方式,训练时大鼠负重为自身体重的6%,依照McArdle的方法推算,其需氧量可增至安静时的4~5倍以上,属于高强度间歇训练[1]。由于强度较大,训练时机体可以形成短暂的缺血缺氧,休息时出现短暂的再灌注现象。从大鼠在水中挣扎情况来看,此次实验强度已达到高强度要求,且大鼠通过一段时间的适应也可完成训练计划。通过体重监测IEP组大鼠体重较E组、C组无显著性差异。此外,平时训练过程中通过观察,发现IEP组大鼠进食、排便情况较E组大鼠更为良好,IEP组大鼠除在第一周适应性游泳时偶尔出现焦躁、乱窜外,此后几周训练都显得较为轻松,出水后都能通过大幅度抖动来甩干体毛,所以,此次实验预处理组所采用的训练模式并未对机体造成疲劳堆积。
3.2 大脑皮质微结构的动态变化
脑作为人体最高调节中枢,其微循环是保证脑完成其调节功能的重要保障。因此本次实验选择大鼠最高调节中枢大脑作为观察对象,对其微结构和超微结构进行跟踪观察发现:1)E1组大鼠微结构观察结果:细胞形态完整,细胞间质均匀致密,可辨认出细胞核;E2组大鼠大脑皮质神经元细胞排列紊乱,多数细胞间质疏松,血管扩张明显,显示脑内出现水肿。E3组大鼠神经元细胞排列紊乱,细胞间质疏松,神经纤维间隙增大,显示脑内有水肿,但是较24 h微结构已有明显好转。2)超微结构观察结果:E1组核膜内陷,溶酶体数量增加线粒体轻微肿胀;E2组胞浆变空,核膜不完整,染色质边聚明显;E3组核膜,核仁内陷,核内出现假包含体,染色质边聚,胞浆内有空泡但是较24 h有明显好转。脑微循环改变将严重影响到脑的功能[3]。在试验中,我们可以发现当脑的微结构损伤时,相应时间段的大脑皮质MDA含量也呈上升趋势,提示:结构的损伤与MDA堆积呈正相关。
运动预处理组微结构的动态改变结果:1)IEP1组大鼠大脑皮质细胞形态完整,细胞间质均匀致密,可辨认出细胞核; IEP2组细胞形态完整,细胞间质均匀致密,细胞核清晰可见;IEP3组虽有部分细胞间见到小空泡但是仍属正常。比较E组微结构改变,一次性力竭对于IEP组造成的损伤显然小得多。2)超微结构结果:IEP1组线粒体轻微肿胀,染色质轻微边聚,但是较C组变化不大,IEP2组核膜内陷,线粒体肿胀提示这一时期脑内可能出现水肿,但是较E2组损伤程度较小。IEP3组大脑皮质线粒体轻微肿胀,血管内皮细胞凹陷,但较正常组并无太大区别,说明机体形态结构上已基本恢复。通过大脑皮质形态结构的动态改变,可以说明:间歇训练作为运动预处理方式可以有效的减轻一次性力竭运动对大脑皮质的损伤。 3.3 间歇训练对大脑皮质缺血再灌注损伤产生保护的可能机制
3.3.1 保证线粒体形态结构的完整性
彭峰林对间歇性低氧训练后大鼠心肌结构进行观察发现间歇低氧适应后能够减轻因低氧引起的心肌线粒体肿胀、线粒体嵴断裂消失,较好的维持线粒体等的正常形态和结构[4]。本次实验电镜观察发现经过预处理训练后的大脑皮质神经元细胞线粒体在遭受缺血再灌注损伤时期形态结构较E组更为完整,特别是在力竭运动后24 h,其差异最为明显。所以推测IEP组大鼠经过6周间歇训练刺激,机体已经对短暂的缺血缺氧产生了适应性,因此,脑结构观察发现IEP1组与C组并无显著差异。24 h时机体遭受再灌注损伤,但是由于之前反复的低氧刺激,IEP2组损伤程度较E2组明显减轻,这可能也是因为IEP组线粒体结构更为完整,使机体能量供应不至于出现代谢障碍,从而机体可以更快更好的清除活性氧,对机体起到保护作用。
3.3.2 增强机体清除自由基能力
本实验为大强度间歇训练,每一次训练机体都处于较强的氧化应激态中,氧自由基的增加可以通过分子机制诱导抗氧化酶发生适应性变化,长期间歇训练,机体处于脉冲式的氧化应激状态中,并通过这种遗传程序诱导增强抗氧化酶的表达,从而实现与有毒的自由基相对抗,对机体进行自我保护。也可能是因为机体在长期的大强度间歇训练中机体产生了低浓度的自由基堆积,进而更大程度地激活了机体抗氧化系统的活力。这也可能是本次实验观察到48小时时机体SOD、GSH-PX仍升高的可能机制。以前也有实验证明低水平的自由基可以促进SOD、GSH-PX等的合成[5]。
3.3.3 增加脑血管微循环能力
彭峰林对间歇性低氧训练后大鼠心肌毛细血管结构进行观察发现间歇运动训练后,毛细血管结构完整,内皮细胞内小泡有所增加,细胞连接无松弛基底膜完整,可见粗面内质网等细胞器。提示间歇低氧和运动适应能使毛细血管密度增加,表明氧运输能力提高了[6]微循环的正常进行对于大脑皮质抗击缺血再灌注损伤有着非常重要的意义,通过大脑皮质形态结构的观察可以发现IEP各组脑血管损伤均较E组有非常显著性减轻。这是因为经过长期的运动预处理,使得大脑皮质毛细血管产生了适应性改变,增加了其获取氧的能力。说明运动预处理对机体摄氧能力的提高不仅仅存在于心肌,在脑内也有同样的适应性改变。
4 结论与建议
4.1 高强度间歇训练作为预处理方式可以有效的保护大脑免受缺血再灌注损伤。
4.2 一次性力竭运动造成的缺血再灌注损伤是可逆的,这种损伤恢复一般要持续到一次性力竭训练后48小时之后。
参考文献:
[1]郑兵,苏全生,熊若虹,等.间歇训练对负荷游泳力竭运动后即刻及恢复期大鼠心肌脂质过氧化及钙离子代谢的影响[J].成都体育学院学报, 2007, 33(5): 92-95.
[2]张梅, 何叶.不同强度运动训练对大鼠海马CA1 区神经元凋亡的影响[J].天津体育学院学报,2006,21(6):151-153.
[3]袁琼嘉,熊若虹,苏全生,等.力竭游泳后大鼠大脑微循环超微结构与自由基代谢动态变化的同步研究[J].生物医学工程学杂志,2006,23(2)∶322-325.
[4]彭峰林,陈建文,邓树勋,等.间歇运动训练对心脏缺血再灌注损伤大鼠心肌抗氧化酶的影响[J].中国运动医学杂志,2008,27(1):97-99.
[5]Dempsey EC, Newton AC, Mochly-Rosen D, et al. Protein kinase C isozymes and the regulation of diverse cell responses[J]. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol ,2000,279(3):L429-L438.
[6]彭峰林.间歇训练对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制的研究[D]//广州:华南师范大学,2007:104.