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摘 要:探讨“高住低练”肝细胞凋亡与凋亡调控基因(包括HIF1α)之 间关系,为低氧训练提供科研资料。方法:健康成年雄性SD大鼠60只,随机分为6组。安静 对照组(C)不训练,不进行低氧暴露;低氧暴露组(HE)和高住低练组(Hilo)每天低氧 暴露(氧浓度12.6%,相当于海拔4 000 m)8 h和12 h,5 d/周,共4周;常氧运动组和高 住低练组每天均以25 m/min的速度训练1 h,5 d/周,共4周。采用免疫组织化学方法和计算 机显 微图像分析系统分析bax、bcl2和HIF1α阳性表达、阳性物质的定位及定量。结果:1)与C组相比实验各组细胞凋亡指数著性升高(p<0.01),Hilo组凋亡指数显著高于HE组 和T组(p<0.01),但12Hilo与8Hilo之间无显著性差异;2) Hilo组的bax蛋白表达与 HE组和T组相比显著增加(p<0.05),随着低氧暴露时间的延长,呈增长趋势;TUNEL与 bax呈正相关(r=0.693,P<0.01);3) HE组bcl2蛋白表达显著高于C组,12 hHE组 的bcl2蛋白表达比8hHE组显著下降(p<0.05);12Hilo组bcl2蛋白表达比8Hilo组 显著下降,但明显高于C组(p<0.05);4) 肝组织bax/ bcl2值显示,C组与12 hHE 组和12Hilo组相比具有显著性意义(p<0.05);T组与Hilo组相比具有非常显著性意义 (p<0.01);5) HIF1α与bax呈高度正相关(r=0.958,p<0.01)。结论:bax 、bcl2与HIF1α基因参与调控肝细胞的凋亡;HIF1α与肝细胞凋亡呈正相关,HIF1 α可能调控bax和bcl2,并与bax呈高度正相关,调控bax高表达而促进肝细胞凋亡。
关键词:高住低练;肝细胞凋亡;凋亡调控基因;低氧诱导因子1α
中图分类号:G804.7文献标识码:A文章编号 :1007-3612(2010)01-0062-05
Relation of Living High/Training Low on Hepatic Apoptosis betwee n Bax, Bcl2 and HIF1α in
SpragueDauley Rats
LIU Wenfeng1, LU Jianqing2, QU Shulin1, TANG Changf a1, LI Jianghua3
(1.Hunan Normal University, Changsha 410012, Hunan China; 2. Xi angnan College, Chenzhou 423000, Hunan China;
3. Jiangxi Normal Universi ty, Nanchang 330027, Jiangxi China)
Abstract: This research studies hepatic apoptotic gene, and applies research dat a for hypoxic training in sports practice applications. It attempts to explore t he relation between apoptotic gene and apoptosis on living high/training low. 60male SD rats are randomly divided into six groups. Group C do not hold hypoxiaand training. Groups HE and Hilo are held in hypoxia chamber (12.5% concentratio ns of oxygen, simulated as a altitude of 4 000 m) with 8h and 12h each day, 5 da ys per week for 4 weeks. Groups T and Hilo are trained at the speed of the 25 m/ min for 1 hour each day, 5 days per week for 4 weeks. Immunohistochemical and co mputer image processing technique are applied to detect positive expression andquantificational analysis for HIF1α,bax and bcl2 protein. As compared withgroup C, the index of apoptosis increases significantly in other experimental g roups(p<0.01). The index of apoptosis occurs significantly in group Hilo mor e than HE and T (p<0.01). The index of apoptosis has nonsignificance in gr oup 8Hilo and 12Hilo. As compared with HE and C, bax in group Hilo increases sig nificantly (p<0.05), and increases slightly with hypoxia long time. It demon strates the correlation (r=0. 693, p<0.01) between TUNEL and bax. Bcl2 i n group HE expresses more than group C, then bcl2 in group 12hHE expresses low er than 8hHE (p<0.05); As compared with 8 Hilo, it shows decrease in group 1 2Hilo, then it is still higher than group C (p<0.05). As compared with C, ba x/ bcl2 shows that there is prominent significance in groups 12hHE and 12Hilo(p<0.05), and as compared with T, there is prominent significance in groupsHilo (p<0.01). It demonstrates the correlation (r=0.958, p<0.01) betwe en HIF1α and bax. In conclusion, Bax, bcl2 and HIF1α gene participates t o adjust liver apoptosis. HIF1αprotein may adjust bax and bcl2, and it is r elated with bax prominently, HIF1αpromotes bax protein expression to induce l iver apoptosis.
Key words: living high/training low; liver apoptosis; apoptotic gene; HI F1α
肝细胞凋亡是个多基因调控的复杂过程,其产生的机制至今尚未完全清楚。目前的研究 多与bcl-2家族有关,bcl-2/bax和bax/bal-xl可抑制细胞凋亡,bax/bcl-2、bax/bax和bax/ bal-xl可促进细胞凋亡[1-4]。bax的作用与bcl-2相反,促进细胞凋亡,许多细胞 的凋亡过程中常伴有bax表达水平的升高,如Kobayashi等[5]转染bax时发现不仅能 够诱导许多细胞发 生自发凋亡,而且可以促进多种因素诱导的多种细胞凋亡。有报道轻度低氧时,激活的HIF- 1α可与HIF-1β相结合,形成异二聚体,可能促进了其目的基因如EPO、VEGF等生成从而可 能促进低氧组织细胞存活;但低氧严重而持续时间长时,HIF-1α可以与P53相结合,从而可 能促进了低氧诱导的凋亡[6]。目前已确定有超过70个基因被HIF-1调控[7] 。而关于“高住低练”肝组织HIF-1α和凋亡相关基因之间关系、凋亡调控基因情况,目 前尚未见到报道。
本实验采用不同持续时间低氧暴露后运动的大鼠实验动物模型,采用TUNEL检测细胞凋 亡,免疫组织化学的方法检测HIF-1α、bax和bcl-2蛋白表达,探讨“高住低练”对肝细胞 凋亡与凋亡调控基因(包括HIF-1α)之间关系的研究,为低氧训练手段在运动实践中的科 学应用提供研究资料。
1 材料与方法
1.1 实验对象及分组
健康成年雄性(Sprague-Dawley,SD)大鼠60只,体重(212.55±15.74)g(购自湖南农业 大学动物中心,许可证号:湘scxk 2003- 003),为清洁级实验动物。以国家标准啮齿类动 物饲料分笼饲养,自由饮食和饮水。实验期间室温为20℃～25℃,相对湿度为45%～55%,每 天光照12 h。
适应性喂养1周后,大鼠按体重随机分为6组,每组10只,即正常对照组(Control grou p,C)、8 h低氧暴露组(8 h hypoxic exposure group,8hHE)、12 h低氧暴露组(12 hhypoxic exposure group,12 h HE)、常氧运动组(purely training group,T)、8 h高 住低练组(8 h Living High-Training Low group,8Hilo)和12 h高住低练组(12 h Livi ng High-Training Low group,12Hilo)。
1.2 实验方案
1.2.1 运动训练安排T和Hilo组采用杭州立泰科技有限公司PT动物实验跑台,每天以25 m/min的速度训练1 h ,每天训练1次,每周5天,共4周。C组和HE组不做动物实验跑台运动。
1.2.2 低氧处理适应一周后,密封低氧帐篷内为固定的12.6%(相当于海拔4 000 m高度)氧含量,8 hHE组 和8Hilo组大鼠于密封低氧帐篷中每天放置8 h,12 hHE组和12Hilo组大鼠于密封低氧帐篷中 每天放置12 h,每周5天,共4周。C组和T组不做低氧处理。
1.3 标本制备
实验结束后,用0.1%戊巴比妥钠1 mL/100 g麻醉大鼠,断头处死。迅速取肝左侧叶,按照长 宽高为5 mm、3 mm、5 mm的标准取样,置于4%的多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1M,pH7.4 PBS) 中固定24 h后进行常规石蜡包埋,每个蜡块每隔20 μm连续切片5张,每张厚5 μm,用于免 疫组织化学和TUNEL检测。
1.4 原位细胞凋亡检测应用TdT进行的末端反应又称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(T UNEL)检测细胞凋亡,按原位细胞凋亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit, POD)说明书操作。
光学显微镜下阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色或棕褐色着染,部分胞浆也可因胞核 DNA碎片溢出而呈阳性着染;正常非凋亡细胞和阴性对照细胞核被苏木素复染成蓝色,核相 对较大,形态大小一致。根据下列标准确定着色阳性细胞为凋亡细胞:1) 单个散在分布 ;2) 具有凋亡的核形态;3) 周围无炎症反应。对于缺乏凋亡核形态的阳性细胞,除非 染色强度与背景有鲜明对比,且呈单个分布,否则不认为是凋亡细胞。光学显微镜(×400 )下每张切片随机观察6个视野,每个视野至少500个细胞水平。以Simple PCI显微图像分析 软件测试每100个细胞中的平均阳性凋亡细胞数,即凋亡指数(Apoptosis Index,AI)[8]。
1.5 bax、bcl-2和HIF-1α的免疫组织化学的测定对肝脏组织中bax、bcl-2和HIF-1α进行定位、定性和定量的研究。具体步骤如下:石蜡切 片脱蜡脱水;用3%的H2O2室温孵育10 min,阻断内源性过氧化物酶;置0.01 mol/L,pH 6.0的柠檬酸(又叫枸橼酸)中,用WD900 AS25 R-2型号Galanz(格兰士)微波炉抗原热修 复,PBS液冲洗5 min×3次,自然冷却;5%～10%山羊血清室温孵育10 min,减少或消除非 特异性染色;滴加50 μL一抗(购自美国Santa Cruz公司)(1:50),置4℃冰箱过夜;室 温孵育15 min,PBS液冲洗5 min×3次;滴加二抗(PV6001/6002二步法检测试剂,购自北京 中杉金桥生物工程有限公司),37℃恒温箱中孵育30 min(烤片);PBS液冲洗5 min×3次 ,用终浓度为0.05%DAB- 0.03% H2O2显色4～5 min,PBS液充分冲洗;苏木素常规染色4 ～5 min,1%的盐酸酒精分色数秒;烘干,中性树胶封片。阴性对照:用PBS代替一抗作为空 白对照。
计算机显微图象分析系统为美国COMPIX Simple PC6.0I生物显微分析图像系统。每组选 片10张,每张切片镜下(×400)随机取5个视野进行分析,bax、bcl-2、HIF-1α的阳性物 质用灰度值(光密度值)和阳性表达面积表示,阳性产物的表达采用一定面积中光密度值与 阳性面积值的乘积做为阳性指数(positive index,PI),即阳性指数=阳性强度光密度值 ×阳性反应面积/测量面积[8]。
1.6 统计学分析所有的数据用平均值±标准差表示;各组间显著性差异采用方差分析、组内显著性差异用双 侧t检验,采用Prarson计算方法进行相关分析;在满足方差齐性条件下使用LSD法(Leas t-significant Difference)和SNK法(Student- Neuman-Keuls)进行多重比较;显著性水平 为α=0.05;所有数据均用SPSS11.5统计学软件进行处理。
2 结 果
2.1 “高住低练”对大鼠一般活动情况及体重的影响安静对照组大鼠形态正常,皮毛光亮,眼睛有神,反应灵敏,进食饮水正常。低氧舱中 的大鼠反应较为迟钝,表现比较兴奋,有用前爪抓或嘴巴咬笼子现象,进食相对减少,低氧 暴露第二周开始没有出现明显不良反应。除安静对照组大鼠外,对光线,声音,搬动笼子较 敏感,训练各组的大鼠进跑台时有逃避现象。
3.2 “高住低练”对大鼠肝组织HIF-1α的影响本实验结果显示只考虑单纯低氧暴露,低氧暴露能促进HIF-1α蛋白表达增加(p<0.05 ),并12h低氧暴露组HIF-1α蛋白表达稍高于8h组。Halterman[15]认为中度缺氧 可使HIF-1 α复合物稳定,引起应答基因表达,但是在持续低氧时间延长及低氧强度加大时,稳定的HI F-1α复合物使细胞内P53水平增加,促进有关病理基因表达,从而导致神经毒性。Bergstro m等[16]证明在0%～20%的范围内,只要氧浓度降低HIF-1αmRNA水平就增加。
本实验结果显示常氧运动也能促进HIF-1α蛋白的表达(p<0.05)。众所周知,一 定强 度的运动就会导致组织细胞内出现低氧现象,即负荷性低氧,例如运动时骨骼肌细胞内氧分 压会降到很低水平(3-4Torr),而且与提供的低氧程度具有一致性[17]。
本实验结果显示高住低练都能促进HIF-1α蛋白表达增加(p<0.05);与单纯低氧 暴露 组相比,高住低练组的HIF-1α蛋白表达要高些;与常氧运动组比较,高住低练组的HIF-1α 蛋白表达更显著(p<0.01)。说明低氧特异感受因子HIF-1α对外界形成的低氧产生适 应性反应,细胞能通过多个通路感受低氧,调控HIF-1α的表达,稳定其活性。黄丽英等 [18]报道氧分压下降时,HIF-1α在胞浆中的表达增高,DNA结合活性也相应增强。
3.3 “高住低练”大鼠肝组织bax/bcl-2与HIF-1α之间的关系HIF-1α对细胞凋亡的影响近年国外渐有报道。有报道说HIF-1在阻止细胞凋亡中起作用 。HIF-1诱导VEGF的表达在保护造血干细胞和阻止神经元细胞凋亡中的作用已被证实[1 9]。但有研究表明HIF-1在细胞凋亡中起促进作用。Carmclieit等[20]将野生型 (rHIF-1α+/+)胚胎干细胞(ES)和利用同源重组方法获得HIF-1α缺陷(rHIF-1α-/-) 的ES细胞同时给予低氧处理后与常氧对照组比较,rHIF-1α+/+ES中凋亡细胞增加10- 30倍, 而rHIF-1α-/-ES的凋亡却未受低氧的影响。于如同等[21]的实验表明,大 鼠颅脑创伤后继发性脑组织缺血、 缺氧可引起细胞凋亡,HIF-1α对细胞凋亡有促进作用。还有研究发现低氧后在大鼠的心肌 细胞有HIF-1α的表达,同时也发现有凋亡相关基因BNIP3的明显表达,从而启动细胞凋亡的 过程,而且这种类型的心肌细胞凋亡不被caspases抑制剂所缓解[22]。
本实验结果显示,TUNEL与HIF-1α呈高度正相关(r=0.770,p<0.01);HIF-1α与 bax呈高度正相关(r=0.958,p<0.01);HIF-1α与bcl-2也呈正相关(r=0.341) ,很明显HIF-1α与bax相关性更高。表明HIF-1α在低氧暴露、常氧运动或低氧训练作用中 上调bax成高表达,呈现bax/bcl-2比例高,促进肝细胞凋亡。Carmeliet等[20]对 胚胎干细胞的研究发现:低氧可诱导正常的胚胎(HIF-1α+/+)细胞凋亡,但在敲出HI F-1α基因的胚胎(HIF-1α-/-) 无细胞凋亡的现象,说明HIF-1α通过调节P53、bcl-2等凋亡相关基因参与了细胞凋亡的过 程。洪欣等[23]的研究结果表明常氧时细胞不表达HIF-1α,低氧可增加HIF-1的表 达,低氧 时,bax的表达变化大致与此相同,P53在低氧时的变化也与其相同,bcl-2在低氧时表达下 降。也有研究表明低氧暴露组HIF-1α及P53蛋白表达均增加,随低氧时间的延长及低氧强度 的增加而增强,HIF-1α及P53的表达呈显著正相关(r=0.97)[24],参与低氧 细胞 凋亡的调控因素有bcl-2家族蛋白、P53和凋亡抑制因子[25]。由于细胞凋亡受多种 基因的调控,缺氧预处理对凋亡相关基因(可能包括HIF-1α)的转录可能具有直接或间接 作用。
4 结 论
Bax、bcl-2与HIF-1α基因参与调控肝细胞的凋亡,HIF-1α与肝细胞凋亡呈高度正相关 ,HIF-1α可能调控bax和bcl-2,并与bax高度相关,调控bax高表达而促进肝细胞凋亡。
参考文献:
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关键词:高住低练;肝细胞凋亡;凋亡调控基因;低氧诱导因子1α
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Key words: living high/training low; liver apoptosis; apoptotic gene; HI F1α
肝细胞凋亡是个多基因调控的复杂过程,其产生的机制至今尚未完全清楚。目前的研究 多与bcl-2家族有关,bcl-2/bax和bax/bal-xl可抑制细胞凋亡,bax/bcl-2、bax/bax和bax/ bal-xl可促进细胞凋亡[1-4]。bax的作用与bcl-2相反,促进细胞凋亡,许多细胞 的凋亡过程中常伴有bax表达水平的升高,如Kobayashi等[5]转染bax时发现不仅能 够诱导许多细胞发 生自发凋亡,而且可以促进多种因素诱导的多种细胞凋亡。有报道轻度低氧时,激活的HIF- 1α可与HIF-1β相结合,形成异二聚体,可能促进了其目的基因如EPO、VEGF等生成从而可 能促进低氧组织细胞存活;但低氧严重而持续时间长时,HIF-1α可以与P53相结合,从而可 能促进了低氧诱导的凋亡[6]。目前已确定有超过70个基因被HIF-1调控[7] 。而关于“高住低练”肝组织HIF-1α和凋亡相关基因之间关系、凋亡调控基因情况,目 前尚未见到报道。
本实验采用不同持续时间低氧暴露后运动的大鼠实验动物模型,采用TUNEL检测细胞凋 亡,免疫组织化学的方法检测HIF-1α、bax和bcl-2蛋白表达,探讨“高住低练”对肝细胞 凋亡与凋亡调控基因(包括HIF-1α)之间关系的研究,为低氧训练手段在运动实践中的科 学应用提供研究资料。
1 材料与方法
1.1 实验对象及分组
健康成年雄性(Sprague-Dawley,SD)大鼠60只,体重(212.55±15.74)g(购自湖南农业 大学动物中心,许可证号:湘scxk 2003- 003),为清洁级实验动物。以国家标准啮齿类动 物饲料分笼饲养,自由饮食和饮水。实验期间室温为20℃～25℃,相对湿度为45%～55%,每 天光照12 h。
适应性喂养1周后,大鼠按体重随机分为6组,每组10只,即正常对照组(Control grou p,C)、8 h低氧暴露组(8 h hypoxic exposure group,8hHE)、12 h低氧暴露组(12 hhypoxic exposure group,12 h HE)、常氧运动组(purely training group,T)、8 h高 住低练组(8 h Living High-Training Low group,8Hilo)和12 h高住低练组(12 h Livi ng High-Training Low group,12Hilo)。
1.2 实验方案
1.2.1 运动训练安排T和Hilo组采用杭州立泰科技有限公司PT动物实验跑台,每天以25 m/min的速度训练1 h ,每天训练1次,每周5天,共4周。C组和HE组不做动物实验跑台运动。
1.2.2 低氧处理适应一周后,密封低氧帐篷内为固定的12.6%(相当于海拔4 000 m高度)氧含量,8 hHE组 和8Hilo组大鼠于密封低氧帐篷中每天放置8 h,12 hHE组和12Hilo组大鼠于密封低氧帐篷中 每天放置12 h,每周5天,共4周。C组和T组不做低氧处理。
1.3 标本制备
实验结束后,用0.1%戊巴比妥钠1 mL/100 g麻醉大鼠,断头处死。迅速取肝左侧叶,按照长 宽高为5 mm、3 mm、5 mm的标准取样,置于4%的多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1M,pH7.4 PBS) 中固定24 h后进行常规石蜡包埋,每个蜡块每隔20 μm连续切片5张,每张厚5 μm,用于免 疫组织化学和TUNEL检测。
1.4 原位细胞凋亡检测应用TdT进行的末端反应又称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(T UNEL)检测细胞凋亡,按原位细胞凋亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit, POD)说明书操作。
光学显微镜下阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色或棕褐色着染,部分胞浆也可因胞核 DNA碎片溢出而呈阳性着染;正常非凋亡细胞和阴性对照细胞核被苏木素复染成蓝色,核相 对较大,形态大小一致。根据下列标准确定着色阳性细胞为凋亡细胞:1) 单个散在分布 ;2) 具有凋亡的核形态;3) 周围无炎症反应。对于缺乏凋亡核形态的阳性细胞,除非 染色强度与背景有鲜明对比,且呈单个分布,否则不认为是凋亡细胞。光学显微镜(×400 )下每张切片随机观察6个视野,每个视野至少500个细胞水平。以Simple PCI显微图像分析 软件测试每100个细胞中的平均阳性凋亡细胞数,即凋亡指数(Apoptosis Index,AI)[8]。
1.5 bax、bcl-2和HIF-1α的免疫组织化学的测定对肝脏组织中bax、bcl-2和HIF-1α进行定位、定性和定量的研究。具体步骤如下:石蜡切 片脱蜡脱水;用3%的H2O2室温孵育10 min,阻断内源性过氧化物酶;置0.01 mol/L,pH 6.0的柠檬酸(又叫枸橼酸)中,用WD900 AS25 R-2型号Galanz(格兰士)微波炉抗原热修 复,PBS液冲洗5 min×3次,自然冷却;5%～10%山羊血清室温孵育10 min,减少或消除非 特异性染色;滴加50 μL一抗(购自美国Santa Cruz公司)(1:50),置4℃冰箱过夜;室 温孵育15 min,PBS液冲洗5 min×3次;滴加二抗(PV6001/6002二步法检测试剂,购自北京 中杉金桥生物工程有限公司),37℃恒温箱中孵育30 min(烤片);PBS液冲洗5 min×3次 ,用终浓度为0.05%DAB- 0.03% H2O2显色4～5 min,PBS液充分冲洗;苏木素常规染色4 ～5 min,1%的盐酸酒精分色数秒;烘干,中性树胶封片。阴性对照:用PBS代替一抗作为空 白对照。
计算机显微图象分析系统为美国COMPIX Simple PC6.0I生物显微分析图像系统。每组选 片10张,每张切片镜下(×400)随机取5个视野进行分析,bax、bcl-2、HIF-1α的阳性物 质用灰度值(光密度值)和阳性表达面积表示,阳性产物的表达采用一定面积中光密度值与 阳性面积值的乘积做为阳性指数(positive index,PI),即阳性指数=阳性强度光密度值 ×阳性反应面积/测量面积[8]。
1.6 统计学分析所有的数据用平均值±标准差表示;各组间显著性差异采用方差分析、组内显著性差异用双 侧t检验,采用Prarson计算方法进行相关分析;在满足方差齐性条件下使用LSD法(Leas t-significant Difference)和SNK法(Student- Neuman-Keuls)进行多重比较;显著性水平 为α=0.05;所有数据均用SPSS11.5统计学软件进行处理。
2 结 果
2.1 “高住低练”对大鼠一般活动情况及体重的影响安静对照组大鼠形态正常,皮毛光亮,眼睛有神,反应灵敏,进食饮水正常。低氧舱中 的大鼠反应较为迟钝,表现比较兴奋,有用前爪抓或嘴巴咬笼子现象,进食相对减少,低氧 暴露第二周开始没有出现明显不良反应。除安静对照组大鼠外,对光线,声音,搬动笼子较 敏感,训练各组的大鼠进跑台时有逃避现象。
3.2 “高住低练”对大鼠肝组织HIF-1α的影响本实验结果显示只考虑单纯低氧暴露,低氧暴露能促进HIF-1α蛋白表达增加(p<0.05 ),并12h低氧暴露组HIF-1α蛋白表达稍高于8h组。Halterman[15]认为中度缺氧 可使HIF-1 α复合物稳定,引起应答基因表达,但是在持续低氧时间延长及低氧强度加大时,稳定的HI F-1α复合物使细胞内P53水平增加,促进有关病理基因表达,从而导致神经毒性。Bergstro m等[16]证明在0%～20%的范围内,只要氧浓度降低HIF-1αmRNA水平就增加。
本实验结果显示常氧运动也能促进HIF-1α蛋白的表达(p<0.05)。众所周知,一 定强 度的运动就会导致组织细胞内出现低氧现象,即负荷性低氧,例如运动时骨骼肌细胞内氧分 压会降到很低水平(3-4Torr),而且与提供的低氧程度具有一致性[17]。
本实验结果显示高住低练都能促进HIF-1α蛋白表达增加(p<0.05);与单纯低氧 暴露 组相比,高住低练组的HIF-1α蛋白表达要高些;与常氧运动组比较,高住低练组的HIF-1α 蛋白表达更显著(p<0.01)。说明低氧特异感受因子HIF-1α对外界形成的低氧产生适 应性反应,细胞能通过多个通路感受低氧,调控HIF-1α的表达,稳定其活性。黄丽英等 [18]报道氧分压下降时,HIF-1α在胞浆中的表达增高,DNA结合活性也相应增强。
3.3 “高住低练”大鼠肝组织bax/bcl-2与HIF-1α之间的关系HIF-1α对细胞凋亡的影响近年国外渐有报道。有报道说HIF-1在阻止细胞凋亡中起作用 。HIF-1诱导VEGF的表达在保护造血干细胞和阻止神经元细胞凋亡中的作用已被证实[1 9]。但有研究表明HIF-1在细胞凋亡中起促进作用。Carmclieit等[20]将野生型 (rHIF-1α+/+)胚胎干细胞(ES)和利用同源重组方法获得HIF-1α缺陷(rHIF-1α-/-) 的ES细胞同时给予低氧处理后与常氧对照组比较,rHIF-1α+/+ES中凋亡细胞增加10- 30倍, 而rHIF-1α-/-ES的凋亡却未受低氧的影响。于如同等[21]的实验表明,大 鼠颅脑创伤后继发性脑组织缺血、 缺氧可引起细胞凋亡,HIF-1α对细胞凋亡有促进作用。还有研究发现低氧后在大鼠的心肌 细胞有HIF-1α的表达,同时也发现有凋亡相关基因BNIP3的明显表达,从而启动细胞凋亡的 过程,而且这种类型的心肌细胞凋亡不被caspases抑制剂所缓解[22]。
本实验结果显示,TUNEL与HIF-1α呈高度正相关(r=0.770,p<0.01);HIF-1α与 bax呈高度正相关(r=0.958,p<0.01);HIF-1α与bcl-2也呈正相关(r=0.341) ,很明显HIF-1α与bax相关性更高。表明HIF-1α在低氧暴露、常氧运动或低氧训练作用中 上调bax成高表达,呈现bax/bcl-2比例高,促进肝细胞凋亡。Carmeliet等[20]对 胚胎干细胞的研究发现:低氧可诱导正常的胚胎(HIF-1α+/+)细胞凋亡,但在敲出HI F-1α基因的胚胎(HIF-1α-/-) 无细胞凋亡的现象,说明HIF-1α通过调节P53、bcl-2等凋亡相关基因参与了细胞凋亡的过 程。洪欣等[23]的研究结果表明常氧时细胞不表达HIF-1α,低氧可增加HIF-1的表 达,低氧 时,bax的表达变化大致与此相同,P53在低氧时的变化也与其相同,bcl-2在低氧时表达下 降。也有研究表明低氧暴露组HIF-1α及P53蛋白表达均增加,随低氧时间的延长及低氧强度 的增加而增强,HIF-1α及P53的表达呈显著正相关(r=0.97)[24],参与低氧 细胞 凋亡的调控因素有bcl-2家族蛋白、P53和凋亡抑制因子[25]。由于细胞凋亡受多种 基因的调控,缺氧预处理对凋亡相关基因(可能包括HIF-1α)的转录可能具有直接或间接 作用。
4 结 论
Bax、bcl-2与HIF-1α基因参与调控肝细胞的凋亡,HIF-1α与肝细胞凋亡呈高度正相关 ,HIF-1α可能调控bax和bcl-2,并与bax高度相关,调控bax高表达而促进肝细胞凋亡。
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