【摘 要】
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目的 构建葡萄糖激酶 (glucokinase ,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系 ,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础。方法 质粒pCMV4 GKZ1经EcoRⅠ BamHⅠ双
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目的 构建葡萄糖激酶 (glucokinase ,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系 ,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础。方法 质粒pCMV4 GKZ1经EcoRⅠ BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN ,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX GK ,采用酶切及测序对重组体进行鉴定。而后脂质体转染PLX GK至包装细胞PA3 17,检测培养上清病毒滴度 ,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR及免疫组化鉴定。结果 构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX GK ,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变 ;建立了稳定产毒细胞系PA3 17 GK ,其培养上清平均病毒滴度为 6.8× 10 5cfu ml,最高为 1.8× 10 6 cfu ml ,PCR及免疫组化证实GK基因整合入PA3 17 GK细胞基因组并有GK的表达。结论 成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的稳定产毒细胞系
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