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摘要：目的：比较测定几种不同动物骨骼肌肌球蛋白重链(MHC)亚型及成肌调节因子(MRFs)基因表达，引物均采用大鼠基因号设计，旨在比较观察其它动物与大鼠基因表达的交叉及相似度。方法：选用大鼠、家兔、牛与人的股外侧肌样本各6个，迅速用TRIZOL试剂匀浆固定，采用实时荧光－PCR法，测定骨骼肌MHC I，IIa，IIx，IIb四种亚型及成肌调节因子(MRFs)的mRNA基因表达。结果：未经内参较正的测定值，人、牛、兔的肌球蛋白重链(MHC)亚型及成肌调节因子(MRFs)基因表达均明显低于大鼠(P<0.01)，提示各物种的同种基因存在差异性，其引物特异性较强；但经过内参校正后的测定值，人的MHC各亚亚基因表达与大鼠含量较接近，有一定的交叉和基因相似性；而牛的含量虽可检出，但仍明显低于大鼠含量(P<0.01)，表明其基因相似性较低；兔与大鼠基因未表现出相似性。提示，各物种同种基因的表达既存在差异性，又有一定的交叉和相似性。其蛋白水平的比较测定有待进一步研究。关键词：股骼肌；基因表达；肌球蛋白重链；成肌调节因子
中图分类号：G804.7
文献标识码：A
文章编号：1007-3612(2011)02-0052-03
人体及各种动物骨骼肌肌球蛋白重链亚型(I型、IIa、IIx和IIb型)存在差异，例如人类缺乏小动物的快IIb亚型蛋白表达，某些大型动物亦与人类相似，固收缩特性亦有很大差别，必须做蛋白水平及基因水平的比较研究，才能弄清骨骼肌收缩的机制。目前国内外关于人和不同动物MHC亚型的比较研究很薄弱，本文从基因表达的角度作初步探索，为下一步进行蛋白水平的比较测定作准备，具有特定的意义。
1 研究方法
1.1动物分组、取样及处理选用清洁级健康雄性SD大鼠6只(购于扬州大学比较动物中心)，6周龄，体重135～150g，作为对照；另选家兔6只，均用戊巴比妥钠腹腔或静注麻醉，宰杀，迅速选取股外侧肌样本。
人的股外侧肌标本少许，取自扬州市某医院，数名腿部外科手术自愿者(事先说明了采样的重要性，因取样极少，手术自愿者很支持；且人的肌肉组成及收缩性能与动物差异较大，相互比较对揭示其收缩性能更有意义，因此采样很必要)。牛的样本取自屠宰现场，亦为股外侧肌，迅速用TRI－ZOL试剂匀浆固定、待测。
1.2测定方法每组取6个样本，用于肌球蛋白重链，(MHC)亚型基因表达的测定。
由上海康成生物公司共同完成Realtime PCR反应。
试剂购于Invitrogen公司，先进行总RNA提取，逆转录按试剂盒说明书操作。
不同梯度的DNA模板，以及eDNA样品分别配置反应体系。PCR反应溶液放于Realtime PCR仪上进行反应。
反应条件是：94℃，5min；35个PCR循环(94℃，10s；58℃，15s；71℃，20s；84℃，5s，收集荧光)。为建立PCR产物熔解曲线，扩增结束后继续从71℃缓慢加热至99℃(每5s升高1℃)。
然后根据标准曲线、熔解曲线及扩增曲线图获得实验数据，使用管家基因ppia(不同样品之间表达量保持基本恒定)作内参，待测基因以内参校正(表1)。
1.3数据统计实验数据均用“均值±标准差”表示，统计、分析用SPSS 15软件进行，组间比较使用独立样本T检验，P<0.05表示具有显著性差异。
2 结果
从表2结果可见：未经内参较正的测定值，人、牛、兔的肌球蛋白重链(MHC)亚型及成肌调节因子(MRFs)基因表达均明显低于大鼠(P<0.01)，提示各物种的同种基因存在差异性，其引物特异性较强；但表3为经过内参校正后的测定值，人的MHC各亚型基因表达与大鼠含量较接近，有一定的交叉和基因相似性；而牛的含量虽可检出，但仍明显低于大鼠含量(P<0.01)，表明其基因相似性较低；另一方面，经内参校正后，人和牛的成肌调节因子MyoDand myogenin仍明显低于大鼠含量，呈现较低的相似度。
3 讨论
3.1不同动物骨骼肌MHC亚型的差异以往的研究显示，人和马等大型动物骨骼肌中未发现有IIB蛋白表达，但有相应的基因存在，人的IIB亚型的基因编码已出现在人类基因组，定位于染色体17上。Graziotti等(2001)用6种单克隆抗体(MABs)比较了三种动物(鼠、马、骆驼)MHC亚型的反应及显色，结果显示，LIB纤维在大哺乳动物如骆驼肌肉中也有表达，且可以是纯合形态，也可以杂合分布。骆驼肌纤维杂合型IIXB、IIAXB比例较高。有关人类与动物的骨骼肌比较研究很缺乏，本研究对此作一探索，为后续研究作准备，具有其特定的意义。
骆驼与大鼠相似，肌纤维的大小、氧化类型：TIB>IIX>IIA，糖酵解能力IIA>IIX>IIB。SDH活性IIB较低(但狗的IIB纤维具有很高的有氧能力)。
另外，全身各部位肌肉的肌纤维类型存在差异，骆驼后肢几种肌肉的II型纤维很高，超过90％，其中IIB比例亦很高，在半腱肌达49.2％；
另据报道，猪的背最长肌MHC IIB转录占67％，但在半腱肌的红肌(慢肌为主)部分则没有表达。但Tanabe等(1999)报道，猪背最长肌MHC IIB转录仅占30％，但在半腱肌的白肌部分占60％。MHC IIB转录的表达在猪的舌肌、膈肌没有发现(主要是慢肌组成)。
本研究初步探索人与几种动物在基因表达水平的交叉及基因相似性，结果在同一大鼠引物下，人的MHC各亚型基因表达与大鼠含量较接近，有一定的交叉和基因相似性；而牛的含量虽可检出，但仍明显低于大鼠含量(P<0.01)，表明其基因相似性较低；另一方面，人和牛的成肌调节因子MyoD and myogenin仍明显低于大鼠含量，呈现较低的相似度。而兔的肌球蛋白重链(MHC)亚型及成肌调节因子(MRFs)基因表达均未检出，与大鼠基因未表现出相似性。这就为下一步进一步进行蛋白水平比较打下基础。
3.2运动训练对骨骼肌MHC亚型的基因表达影响运动训练对骨骼肌MHC及基因表达的影响随着运动持续的时间及运动强度不同而有不同的变化。Allen等(2001)报道了小鼠心肌和骨骼肌对滚轮耐力运动的适应变化。结果显示，在骨骼肌，无论采用电泳还是组化方法，运动2周后腓肠肌和胫前肌表达MHC IIa的肌纤维百分数均明显升高；4周运动后两种肌肉表达MHC IIb的肌纤维百分数则明显降低，呈现MHC IIb向IIa表达的转变，即“由快到慢”的变化趋势。Bigard等(1999)研究了五周耐力训练对雄性Wistar大鼠趾长伸肌的MHC的影响，结果表明，MHC I、Ⅱa和Ⅱx含量耐力组明显高于对照组，同时MHEIIb的浓度则相应有所下降，即呈现“由快到慢”的变化趋势。潘同斌(2005)年报道，急性低氧或力竭运动后，MHC各亚 型mRNA的表达量总体上表现为上升趋势。另一方面，MHC各亚型mRNA所占百分比的分析显示，一次力竭性运动可能刺激MHC mRNA的表达出现“由快到慢”的变化趋势。Holm L(2008)报道了重负荷和轻负荷强度抗阻训练对人股四头肌的体积及MHC组成的影响。结果显示，重负荷组(70％最大负荷)在12周后出现骨骼肌肥大，且快MHC IIx亚型的蛋白表达下降；而轻负荷组(15.5％最大负荷)的变化不显著。
本文暂未涉及运动模型下的骨骼肌MHC亚型变化，关于人与不同动物在运动模型下骨骼肌肌纤维类型变化的比较研究有待进一步深入。
3.3运动训练对成肌调节因子的影响肌细胞损伤后的再生由一群单核细胞，即卫星细胞来执行，卫星细胞在未损伤的肌肉以静息细胞的形式存在，但它在受损伤肌肉处被激活，分化并修复损伤。肌卫星细胞激活及成肌细胞的分化受到MyoD家族的螺旋－环－螺旋结构的转录因子的调节，运动训练对成肌调节因子的影响也日益受到重视。
Merete Ekmark等(2007)研究表明，成肌调节因子(MRFs)作为骨骼肌表达的重要调节途径，MyoD在快肌中的表达较高，而慢肌中myogerin表达水平较高；MyoD由于去磷酸化而被激活，可促进鼠类动物骨骼肌的快MHC表达；而慢肌中，MyoD则由于磷酸化而处于失活状态，同时，慢频率的电刺激有着相似的效应；可见不同的成肌调节因子对快、慢肌的表达有针对性的调节作用。Peterson JM(2008)比较研究了瘦鼠和肥胖鼠卫星细胞分化的强弱，以及负荷运动对其影响。结果显示，肥胖鼠由于卫星细胞分化较弱而出现肌肉含量较少，同时成肌调节因子Myogenin，MyoD，and Akt的蛋白表达也比较低；但负荷运动可以改善上述变化，能起到一定的补偿作用。
曾缨等(2004)观察了成肌调节因子MyoD和myogenin在肌肉损伤修复过程中的动态变化，结果显示myogenin则在肌肉损伤后24h开始表达，72h达到峰值；MyoD在肌肉损伤后18h开始表达，48h达到峰值。由此可见，MyoD和myogenin在肌肉损伤后的修复再生过程中起着重要作用，可作为鉴定骨骼肌前体细胞和反映肌肉修复再生的指标。Siu等(2004)研究报道，在耐力训练8周后，大鼠比目鱼肌中myogenin和氧化酶的基因表达明显提高，且二者呈现正相关。其中myogenin mRNA的表达升高25％，myo－genin／MyoD mRNA的比值则升高28％；Western Blotting测定显示，蛋白水平的表达也有相应的增高。
Willoughby等(2002)研究了一次重阻力训练课对人体MHC亚型mRNA及转录因子MyoD、myogenin及Id-1mRNA表达的影响。结果显示，训练组在运动后6h，MHC I型、IIa和IIx mRNA分别提高了38.19％、45.61％和74.24％(P<0.05)。即一次重阻力训练课后，人体骨骼肌三种MHC亚型表达均得到上调，myogenin和MyoD mR－NA在运动后即刻和运动后6h也得到显著提高(P<0.05)；但Id－1 mRNA的表达则未发生变化。结果还发现，myogenin在慢肌中表达水平较高，似乎与I型、IIa型MHC亚型的表达有关；而MyoD则在快肌中表达水平较高，似乎与人体的MHC IIx表达有关。
关于不同运动模型下，成肌调节因子(MRFs)的变化及其对骨骼肌MHC亚型的调节机制，亦有待进一步研究。
4 结论
本研究以太鼠基因号设计引物，比较测定几种动物基因表达的交叉及相似度。结果：经过内参校正后的测定值，人的MHC各亚型基因表达与大鼠含量较接近，有一定的交叉和基因相似性；而牛的含量虽可检出，但仍明显低于大鼠含量(P<0.01)，表明其基因相似性较低；人和牛的成肌调节因子MyoD and myogenin亦明显低于大鼠含量，呈现较低的相似度。兔与大鼠基因未表现出相似性。提示，各物种同种基因的表达既存在差异性，又有一定的交叉和相似性。关于人与动物蛋白水平的比较测定有待进一步研究。
中图分类号：G804.7
文献标识码：A
文章编号：1007-3612(2011)02-0052-03
人体及各种动物骨骼肌肌球蛋白重链亚型(I型、IIa、IIx和IIb型)存在差异，例如人类缺乏小动物的快IIb亚型蛋白表达，某些大型动物亦与人类相似，固收缩特性亦有很大差别，必须做蛋白水平及基因水平的比较研究，才能弄清骨骼肌收缩的机制。目前国内外关于人和不同动物MHC亚型的比较研究很薄弱，本文从基因表达的角度作初步探索，为下一步进行蛋白水平的比较测定作准备，具有特定的意义。
1 研究方法
1.1动物分组、取样及处理选用清洁级健康雄性SD大鼠6只(购于扬州大学比较动物中心)，6周龄，体重135～150g，作为对照；另选家兔6只，均用戊巴比妥钠腹腔或静注麻醉，宰杀，迅速选取股外侧肌样本。
人的股外侧肌标本少许，取自扬州市某医院，数名腿部外科手术自愿者(事先说明了采样的重要性，因取样极少，手术自愿者很支持；且人的肌肉组成及收缩性能与动物差异较大，相互比较对揭示其收缩性能更有意义，因此采样很必要)。牛的样本取自屠宰现场，亦为股外侧肌，迅速用TRI－ZOL试剂匀浆固定、待测。
1.2测定方法每组取6个样本，用于肌球蛋白重链，(MHC)亚型基因表达的测定。
由上海康成生物公司共同完成Realtime PCR反应。
试剂购于Invitrogen公司，先进行总RNA提取，逆转录按试剂盒说明书操作。
不同梯度的DNA模板，以及eDNA样品分别配置反应体系。PCR反应溶液放于Realtime PCR仪上进行反应。
反应条件是：94℃，5min；35个PCR循环(94℃，10s；58℃，15s；71℃，20s；84℃，5s，收集荧光)。为建立PCR产物熔解曲线，扩增结束后继续从71℃缓慢加热至99℃(每5s升高1℃)。
然后根据标准曲线、熔解曲线及扩增曲线图获得实验数据，使用管家基因ppia(不同样品之间表达量保持基本恒定)作内参，待测基因以内参校正(表1)。
1.3数据统计实验数据均用“均值±标准差”表示，统计、分析用SPSS 15软件进行，组间比较使用独立样本T检验，P<0.05表示具有显著性差异。
2 结果
从表2结果可见：未经内参较正的测定值，人、牛、兔的肌球蛋白重链(MHC)亚型及成肌调节因子(MRFs)基因表达均明显低于大鼠(P<0.01)，提示各物种的同种基因存在差异性，其引物特异性较强；但表3为经过内参校正后的测定值，人的MHC各亚型基因表达与大鼠含量较接近，有一定的交叉和基因相似性；而牛的含量虽可检出，但仍明显低于大鼠含量(P<0.01)，表明其基因相似性较低；另一方面，经内参校正后，人和牛的成肌调节因子MyoDand myogenin仍明显低于大鼠含量，呈现较低的相似度。
3 讨论
3.1不同动物骨骼肌MHC亚型的差异以往的研究显示，人和马等大型动物骨骼肌中未发现有IIB蛋白表达，但有相应的基因存在，人的IIB亚型的基因编码已出现在人类基因组，定位于染色体17上。Graziotti等(2001)用6种单克隆抗体(MABs)比较了三种动物(鼠、马、骆驼)MHC亚型的反应及显色，结果显示，LIB纤维在大哺乳动物如骆驼肌肉中也有表达，且可以是纯合形态，也可以杂合分布。骆驼肌纤维杂合型IIXB、IIAXB比例较高。有关人类与动物的骨骼肌比较研究很缺乏，本研究对此作一探索，为后续研究作准备，具有其特定的意义。
骆驼与大鼠相似，肌纤维的大小、氧化类型：TIB>IIX>IIA，糖酵解能力IIA>IIX>IIB。SDH活性IIB较低(但狗的IIB纤维具有很高的有氧能力)。
另外，全身各部位肌肉的肌纤维类型存在差异，骆驼后肢几种肌肉的II型纤维很高，超过90％，其中IIB比例亦很高，在半腱肌达49.2％；
另据报道，猪的背最长肌MHC IIB转录占67％，但在半腱肌的红肌(慢肌为主)部分则没有表达。但Tanabe等(1999)报道，猪背最长肌MHC IIB转录仅占30％，但在半腱肌的白肌部分占60％。MHC IIB转录的表达在猪的舌肌、膈肌没有发现(主要是慢肌组成)。
本研究初步探索人与几种动物在基因表达水平的交叉及基因相似性，结果在同一大鼠引物下，人的MHC各亚型基因表达与大鼠含量较接近，有一定的交叉和基因相似性；而牛的含量虽可检出，但仍明显低于大鼠含量(P<0.01)，表明其基因相似性较低；另一方面，人和牛的成肌调节因子MyoD and myogenin仍明显低于大鼠含量，呈现较低的相似度。而兔的肌球蛋白重链(MHC)亚型及成肌调节因子(MRFs)基因表达均未检出，与大鼠基因未表现出相似性。这就为下一步进一步进行蛋白水平比较打下基础。
3.2运动训练对骨骼肌MHC亚型的基因表达影响运动训练对骨骼肌MHC及基因表达的影响随着运动持续的时间及运动强度不同而有不同的变化。Allen等(2001)报道了小鼠心肌和骨骼肌对滚轮耐力运动的适应变化。结果显示，在骨骼肌，无论采用电泳还是组化方法，运动2周后腓肠肌和胫前肌表达MHC IIa的肌纤维百分数均明显升高；4周运动后两种肌肉表达MHC IIb的肌纤维百分数则明显降低，呈现MHC IIb向IIa表达的转变，即“由快到慢”的变化趋势。Bigard等(1999)研究了五周耐力训练对雄性Wistar大鼠趾长伸肌的MHC的影响，结果表明，MHC I、Ⅱa和Ⅱx含量耐力组明显高于对照组，同时MHEIIb的浓度则相应有所下降，即呈现“由快到慢”的变化趋势。潘同斌(2005)年报道，急性低氧或力竭运动后，MHC各亚 型mRNA的表达量总体上表现为上升趋势。另一方面，MHC各亚型mRNA所占百分比的分析显示，一次力竭性运动可能刺激MHC mRNA的表达出现“由快到慢”的变化趋势。Holm L(2008)报道了重负荷和轻负荷强度抗阻训练对人股四头肌的体积及MHC组成的影响。结果显示，重负荷组(70％最大负荷)在12周后出现骨骼肌肥大，且快MHC IIx亚型的蛋白表达下降；而轻负荷组(15.5％最大负荷)的变化不显著。
本文暂未涉及运动模型下的骨骼肌MHC亚型变化，关于人与不同动物在运动模型下骨骼肌肌纤维类型变化的比较研究有待进一步深入。
3.3运动训练对成肌调节因子的影响肌细胞损伤后的再生由一群单核细胞，即卫星细胞来执行，卫星细胞在未损伤的肌肉以静息细胞的形式存在，但它在受损伤肌肉处被激活，分化并修复损伤。肌卫星细胞激活及成肌细胞的分化受到MyoD家族的螺旋－环－螺旋结构的转录因子的调节，运动训练对成肌调节因子的影响也日益受到重视。
Merete Ekmark等(2007)研究表明，成肌调节因子(MRFs)作为骨骼肌表达的重要调节途径，MyoD在快肌中的表达较高，而慢肌中myogerin表达水平较高；MyoD由于去磷酸化而被激活，可促进鼠类动物骨骼肌的快MHC表达；而慢肌中，MyoD则由于磷酸化而处于失活状态，同时，慢频率的电刺激有着相似的效应；可见不同的成肌调节因子对快、慢肌的表达有针对性的调节作用。Peterson JM(2008)比较研究了瘦鼠和肥胖鼠卫星细胞分化的强弱，以及负荷运动对其影响。结果显示，肥胖鼠由于卫星细胞分化较弱而出现肌肉含量较少，同时成肌调节因子Myogenin，MyoD，and Akt的蛋白表达也比较低；但负荷运动可以改善上述变化，能起到一定的补偿作用。
曾缨等(2004)观察了成肌调节因子MyoD和myogenin在肌肉损伤修复过程中的动态变化，结果显示myogenin则在肌肉损伤后24h开始表达，72h达到峰值；MyoD在肌肉损伤后18h开始表达，48h达到峰值。由此可见，MyoD和myogenin在肌肉损伤后的修复再生过程中起着重要作用，可作为鉴定骨骼肌前体细胞和反映肌肉修复再生的指标。Siu等(2004)研究报道，在耐力训练8周后，大鼠比目鱼肌中myogenin和氧化酶的基因表达明显提高，且二者呈现正相关。其中myogenin mRNA的表达升高25％，myo－genin／MyoD mRNA的比值则升高28％；Western Blotting测定显示，蛋白水平的表达也有相应的增高。
Willoughby等(2002)研究了一次重阻力训练课对人体MHC亚型mRNA及转录因子MyoD、myogenin及Id-1mRNA表达的影响。结果显示，训练组在运动后6h，MHC I型、IIa和IIx mRNA分别提高了38.19％、45.61％和74.24％(P<0.05)。即一次重阻力训练课后，人体骨骼肌三种MHC亚型表达均得到上调，myogenin和MyoD mR－NA在运动后即刻和运动后6h也得到显著提高(P<0.05)；但Id－1 mRNA的表达则未发生变化。结果还发现，myogenin在慢肌中表达水平较高，似乎与I型、IIa型MHC亚型的表达有关；而MyoD则在快肌中表达水平较高，似乎与人体的MHC IIx表达有关。
关于不同运动模型下，成肌调节因子(MRFs)的变化及其对骨骼肌MHC亚型的调节机制，亦有待进一步研究。
4 结论
本研究以太鼠基因号设计引物，比较测定几种动物基因表达的交叉及相似度。结果：经过内参校正后的测定值，人的MHC各亚型基因表达与大鼠含量较接近，有一定的交叉和基因相似性；而牛的含量虽可检出，但仍明显低于大鼠含量(P<0.01)，表明其基因相似性较低；人和牛的成肌调节因子MyoD and myogenin亦明显低于大鼠含量，呈现较低的相似度。兔与大鼠基因未表现出相似性。提示，各物种同种基因的表达既存在差异性，又有一定的交叉和相似性。关于人与动物蛋白水平的比较测定有待进一步研究。