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根据甜味蛋白Brazzein基因成熟区的氨基酸序列，结合毕赤酵母的密码子偏爱性以及Brazzein蛋白质结构的相关研究，对甜味蛋白Brazzein基因进行改造，使表达的目的蛋白中包含3个突变氨基酸（29Asp→Lys，31His→Ala，41Glu→Lys）。采用重叠PCR（SOE—PCR）合成目的基因并克隆到pMD18-T载体，经测序鉴定，序列正确的质粒用EcoRI和XbaI双酶切。将回收得到的目的基因连接到经同样双酶切处理的pGAPZαA载体上，经PCR、酶切和测序鉴定，证明已成功构建pGAPZaA—