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摘 要：本文從外植体的消毒、培养基的选择、植物生长调节剂配方、种子萌发形态变化、防治褐化方法、外源添加物质等方面综述了目前山兰种子无菌繁殖的研究进展，并对未来山兰组织培养技术进行分析与展望。
山兰[Oreorchis patens（Lindl.）Lindl.]是兰科山兰属多年生草本植物，分布于我国西南、华中、西北、东北各地，日本、朝鲜半岛至西伯利亚也有分布，干燥球茎入药，甘、辛、寒、有小毒，具有滋阴清肺、化痰止咳的功效，用于痈疳、疮肿、瘰疬、无名肿毒[1]，亦作山慈菇入药[2]。目前自然条件下的山兰，只能利用其假磷球茎分生繁殖，繁殖系数低，每年只能分化出1～2子球[4]。难以满足市场的需求，而有性繁殖至今没有成功的报道。因此导致其商品价格上涨，野生资源遭到极大破坏。为实现山兰的集约化、规模化生产，提高繁殖系数、降低生产成本，不少学者开展了山兰组培繁殖的研究，为山兰的生产繁殖和野生资源的保护提供了重要的理论基础，具有重要的参考价值。
1 消毒方法
不同的外植体材料所选用的消毒方法和消毒时间不同。山兰种子通常的消毒步骤：洗衣粉浸泡5～10min，蒴果置于流水下冲洗数小时，后至少利用两种类型的消毒剂进行消毒、清洗。蒴果在清洗时应保证其完整性，破裂的蒴果不能作为实验材料。张正海等在研究关于山兰种子无菌萌发时[3]，流水浸泡蒴果8h，采用了75%的酒精和0.15%氯化汞组合进行蒴果的消毒处理，种子的萌发效果较好，污染低。在类似实验研究中，为探究独蒜兰种子的最佳消毒组合时，李斌等[5]发现用75%的酒精和0.1%氯化汞组合消毒时，效果较佳，种子污染率低至26%。王跃华[8]等在关于杜鹃兰种子快速萌发的研究中表明，杜鹃兰0.1%升汞消毒最佳时间为6min，此时种子的染菌率低（15.6%），而存活率高（95.7%）。因此，结合其他的研究结果，山兰种子消毒剂组合以升汞+酒精较好，较常见的组合消毒剂还有升汞+次氯酸钠，同时山兰种子消毒需要把握好时间，时间过长易导致种子死亡而无法萌发。
2 培养基的选择
2.1 山兰基础培养基的选择
培养基是外植体材料赖以生存和发展的营养基础。不同种类、不同植物部位组织，对营养的要求都不尽相同，因此筛选合适的培养基，是植物组织培养极为重要的内容。目前山兰组织培养最为常见的培养基为MS培养基。2015年张正海、张悦等[6]用MS、B5和White三种培养基，就含盐量和高压灭菌对培养基酸碱度的影响问题进行实验研究，结果表明培养基酸碱度缓冲能力随含盐量增加而增加。山兰种子的萌发需要长达60～70d的时间，故选择无机盐含量高且酸碱度缓冲能力强的MS培养基。
2017年张海正等[6]在探究MS培养基盐含量对山兰种子萌发的影响时，发现种子在MS、1/2MS培养基的萌发率显著高于
1/4MS培养基，且MS、1/2MS培养基之间萌发数的差异不大。
2.2 山兰种子在MS固体培养基与MS液体培养基培养的讨论
张海正等[3]通过山兰种子的组培实验，详细的记录了山兰种子萌发过程中形态变化的主要阶段（从种子分化成胚细胞时开始详细记录）。先是种子包被在种皮内，种子胚细胞吸水膨胀。进而种子发育成心形胚，变成黄绿色，冲破种皮限制。随后胚根开始分化根毛，分化出子叶和大量根毛，形成黄绿色的原球茎。后又分化成浅绿色的球茎。而白芨种子萌发时首先种胚吸水膨大，颜色转绿，进而突破种皮形成原球茎，原球茎长出叶片和根，部分原球茎转变为根状茎，最后成苗[9]。总体上看，山兰种子与白芨种子在萌发阶段与形态上有相似性，故在培养基的选择，可参照白芨的培养基类型。
赵垚[10]等在分析白芨种子于MS固体培养基、MS液体培养基两种介质上萌发、生长的差异时发现，白芨种子用液体培养基培养时，长达60天也无法形成典型的真根，但种子的萌发率优于固体培养基，且有利于原球茎的增大。就MS的固体培养基而言，有真根的形成且根生长迅速。
综上所述，山兰种子可借鉴白芨的培养方案，在MS液体培养基中种子吸收营养水分，在短时间内得到大量原球茎，后及时将大量原球茎分装至MS固体培养基可得试管苗，经炼苗、移栽最终形成大量山兰幼苗。
3 植物生长调节剂
植物生长调节剂用量虽小，但培养基却培养基在的关键性物质，是组织培养的“秘诀”。不同类型、不同配比关系、不同浓度的生长调节剂对植物生长不同时期的生长分化都起着决定性调
节作用。张海正等[3]发现山兰种子适宜萌发培养基为MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L。且在此种条件下，山兰的原球茎和横走茎的发育诱导效果都不错，而NAA含量降低利于原球茎分化，6-BA含量的增加利于横走茎的分化。张海正等[7]发现，以MS培养基为基础，分裂素TDZ、ZT、6-BA、KT作用于原球茎增殖时，6-BA效果相对较佳，且增殖效果有随6-BA浓度增加呈先增大后降低的趋势。生长素2，4-D、NAA、IBA、IAA作用于原球茎增殖时，NAA的增殖效果明显。在6-BA 5mg/L+NAA 8.0mg/L组合时原球茎增值效果最佳;分裂素ZT、6-BA、KT作用于原球茎分化时，原球茎分化为球茎效果最佳的是KT，且分化系数有随KT浓度增加呈先增大后降低的趋势。生长素IBA、IAA作用于原球茎增殖时，IBA原球茎分化为球茎效果较好。在KT 2.5mg/L+IBA 2.5mg/L组合时原球茎分化效果最佳;在山兰生根培养阶段采用6-BA 0.1mg/L+IAA 2.5mg/L的组合，其生根效果较佳，达6.6条/球茎。
总结来看山兰组培激素配比方案，可参照以下结果：
萌发培养为MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L
球茎增值培养为6-BA 5mg/L+NAA 8.0mg/L 原球莖分化培养为KT 2.5mg/L+IBA 2.5mg/L
生根培养为6-BA 0.1mg/L+IAA 2.5mg/L
4 讨论与展望
目前关于山兰的组织培养技术的研究中，关于植物生长调节剂及培养条件的分析比较常见，但就培养过程中防治污染、褐化及添加外源物质方面的资料较少。而亲缘植物杜鹃兰原球茎的抗褐化研究表明[15]，在五种抗褐化剂中，抗褐化效果依次为AC （300mg·L-1）>GSH（75mg·L-1）>Vc（50mg·L-1）>Na2S2O3（15 mg·L-1）>PVP（3000mg·L-1），此类研究，将对山兰的组织培养中有一定的借鉴和启示作用。
兰科植物组培过程当中利用较多的外源添加物质常有蛋白质、马铃薯汁、椰乳和香蕉汁等。这些物质中含有一定量激素、氨基酸和维生素及其他营养物。研究发现，这类物质对植物的组织培养有显著的促进作用。朱根发[11]等研究发现香蕉对酸碱有很强的缓冲能力，对植物的生长和增殖具有促进作用，山兰种子萌发周期较长，可加入香蕉汁，起到酸碱缓存的作用;李斌等[5]研究发现，培养基中加入香蕉有助于独蒜兰种子萌发，二人的结论相符。石丽敏等[12]研究表明，兰科种子萌发过程中不需要刻意加入外源物质，兰科药用植物种子萌发完全依赖内生真菌提供必要的碳源、氮源等多种营养物质。而在生根壮苗的过程中可加入一定的蔗糖以补充碳源，促进植物生长发育;孟肖[13]在培养基中添加番茄汁30g/L、马铃薯汁30g/L有助于白芨种子萌发并提高增殖率;李霖明[14]研究分析表明，椰汁含有某种特殊物质有助于诱导根茎出芽、提高胚的萌发率。因此在山兰组织的萌发培养中可适当添加椰汁，促进胚的萌发。在分化、生根培养阶段加入适量的蔗糖、马铃薯汁或番茄汁以补充氮源、微量元素等。此外在培养基在加入活性炭，可以有效吸附植物体的分泌物及一些有毒物质。此后的在山兰组织培养研究中，可以进一步的去探寻有机物质在组织培养在中对植物萌发、增殖、分化、生长等方面的促进作用。
朱桢煜等[4]将山兰球茎一分为二、一分为四进行组培繁殖，可以提高其繁殖系数。山兰种子小、数量多，可以提供足够的组培材料。对山兰种子进行组培繁殖将有效的提高其繁殖系数、实现短期内获取大量种苗的目标、为其规模化、集约化生产提供技术条件。山兰种子组培技术的进一步成熟，将有效的满足市场需求，同时也将对野生资源的保护作出重要贡献。
参考文献
[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1999.
[2] 中国药材公司.中国中药资源志要[M].北京：科学出版社，1994： 1553.
[3] 张正海，张悦，张亚玉，等.山兰种子无菌萌发及形态变化研究[J].特产研究，2017，39（02）：5-8.
[4] 朱祯煜，姚百宁，马艳丽.长白山山兰繁殖技术研究[J].南方农机，2020，51（05）：20+30.
[5] 李斌，陈杰，叶鹏.独蒜兰离体快繁技术研究[J].湖南林业科技，2019，（04）：17-22.
[6] 张正海，张悦，李爱民，等.盐含量和高压灭菌对培养基酸碱度和凝固状态的影响[J]..浙江农业学报，2015，27（10）：1757-1760.
[7] 张正海，张亚玉，孙海，等.山兰萌发种子定向培养成苗技术研究[J].特产研究，2019，41（04）：53-56+67.
[8] 王跃华，陈芳，陈燕，等.杜鹃兰种子快速萌发产生原球茎研究[J].种子，2020，39（09）：147-150.
[9] 张燕，黎斌，李思锋.不同培养基上白芨的种子萌发与幼苗形态发生[J].西北植物学报，2009，29（8）：1584-1589.
[10] 赵垚，曹小勇，杨国鹏，等.白芨种子在3种介质上萌发及生长比较[J].江苏农业科学，2021（04）：87-92.
[11] 朱根发，蒋明殿.大花蕙兰的组织培养和快速繁殖技术[J]..广东农业科学，2004（4）：36-38.
[12] 石丽敏，宋费玲，许巧贤，等.蔗糖浓度对白芨种子培养的影响[J].浙江农业科学，2021（02）：297-298+338.
[13] 孟肖，陈娜，张皖秋，等.外源添加物对白芨种苗生长发育状况的影响[J].江苏农业科学，2020（12）：123-128.
[14] 李霖明，钟云芳，宋希强，等.光照环境和天然椰汁对地宝兰根状茎生长与分化的影响[J].广东农业科学，2012（19）：45-47+1.
[15] 叶睿华，吕享，李小兰，等.五种抗褐化剂对杜鹃兰原球茎增殖培养的作用效果[J].植物生理学报，2018，54（06）：1103-1110.
山兰[Oreorchis patens（Lindl.）Lindl.]是兰科山兰属多年生草本植物，分布于我国西南、华中、西北、东北各地，日本、朝鲜半岛至西伯利亚也有分布，干燥球茎入药，甘、辛、寒、有小毒，具有滋阴清肺、化痰止咳的功效，用于痈疳、疮肿、瘰疬、无名肿毒[1]，亦作山慈菇入药[2]。目前自然条件下的山兰，只能利用其假磷球茎分生繁殖，繁殖系数低，每年只能分化出1～2子球[4]。难以满足市场的需求，而有性繁殖至今没有成功的报道。因此导致其商品价格上涨，野生资源遭到极大破坏。为实现山兰的集约化、规模化生产，提高繁殖系数、降低生产成本，不少学者开展了山兰组培繁殖的研究，为山兰的生产繁殖和野生资源的保护提供了重要的理论基础，具有重要的参考价值。
1 消毒方法
不同的外植体材料所选用的消毒方法和消毒时间不同。山兰种子通常的消毒步骤：洗衣粉浸泡5～10min，蒴果置于流水下冲洗数小时，后至少利用两种类型的消毒剂进行消毒、清洗。蒴果在清洗时应保证其完整性，破裂的蒴果不能作为实验材料。张正海等在研究关于山兰种子无菌萌发时[3]，流水浸泡蒴果8h，采用了75%的酒精和0.15%氯化汞组合进行蒴果的消毒处理，种子的萌发效果较好，污染低。在类似实验研究中，为探究独蒜兰种子的最佳消毒组合时，李斌等[5]发现用75%的酒精和0.1%氯化汞组合消毒时，效果较佳，种子污染率低至26%。王跃华[8]等在关于杜鹃兰种子快速萌发的研究中表明，杜鹃兰0.1%升汞消毒最佳时间为6min，此时种子的染菌率低（15.6%），而存活率高（95.7%）。因此，结合其他的研究结果，山兰种子消毒剂组合以升汞+酒精较好，较常见的组合消毒剂还有升汞+次氯酸钠，同时山兰种子消毒需要把握好时间，时间过长易导致种子死亡而无法萌发。
2 培养基的选择
2.1 山兰基础培养基的选择
培养基是外植体材料赖以生存和发展的营养基础。不同种类、不同植物部位组织，对营养的要求都不尽相同，因此筛选合适的培养基，是植物组织培养极为重要的内容。目前山兰组织培养最为常见的培养基为MS培养基。2015年张正海、张悦等[6]用MS、B5和White三种培养基，就含盐量和高压灭菌对培养基酸碱度的影响问题进行实验研究，结果表明培养基酸碱度缓冲能力随含盐量增加而增加。山兰种子的萌发需要长达60～70d的时间，故选择无机盐含量高且酸碱度缓冲能力强的MS培养基。
2017年张海正等[6]在探究MS培养基盐含量对山兰种子萌发的影响时，发现种子在MS、1/2MS培养基的萌发率显著高于
1/4MS培养基，且MS、1/2MS培养基之间萌发数的差异不大。
2.2 山兰种子在MS固体培养基与MS液体培养基培养的讨论
张海正等[3]通过山兰种子的组培实验，详细的记录了山兰种子萌发过程中形态变化的主要阶段（从种子分化成胚细胞时开始详细记录）。先是种子包被在种皮内，种子胚细胞吸水膨胀。进而种子发育成心形胚，变成黄绿色，冲破种皮限制。随后胚根开始分化根毛，分化出子叶和大量根毛，形成黄绿色的原球茎。后又分化成浅绿色的球茎。而白芨种子萌发时首先种胚吸水膨大，颜色转绿，进而突破种皮形成原球茎，原球茎长出叶片和根，部分原球茎转变为根状茎，最后成苗[9]。总体上看，山兰种子与白芨种子在萌发阶段与形态上有相似性，故在培养基的选择，可参照白芨的培养基类型。
赵垚[10]等在分析白芨种子于MS固体培养基、MS液体培养基两种介质上萌发、生长的差异时发现，白芨种子用液体培养基培养时，长达60天也无法形成典型的真根，但种子的萌发率优于固体培养基，且有利于原球茎的增大。就MS的固体培养基而言，有真根的形成且根生长迅速。
综上所述，山兰种子可借鉴白芨的培养方案，在MS液体培养基中种子吸收营养水分，在短时间内得到大量原球茎，后及时将大量原球茎分装至MS固体培养基可得试管苗，经炼苗、移栽最终形成大量山兰幼苗。
3 植物生长调节剂
植物生长调节剂用量虽小，但培养基却培养基在的关键性物质，是组织培养的“秘诀”。不同类型、不同配比关系、不同浓度的生长调节剂对植物生长不同时期的生长分化都起着决定性调
节作用。张海正等[3]发现山兰种子适宜萌发培养基为MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L。且在此种条件下，山兰的原球茎和横走茎的发育诱导效果都不错，而NAA含量降低利于原球茎分化，6-BA含量的增加利于横走茎的分化。张海正等[7]发现，以MS培养基为基础，分裂素TDZ、ZT、6-BA、KT作用于原球茎增殖时，6-BA效果相对较佳，且增殖效果有随6-BA浓度增加呈先增大后降低的趋势。生长素2，4-D、NAA、IBA、IAA作用于原球茎增殖时，NAA的增殖效果明显。在6-BA 5mg/L+NAA 8.0mg/L组合时原球茎增值效果最佳;分裂素ZT、6-BA、KT作用于原球茎分化时，原球茎分化为球茎效果最佳的是KT，且分化系数有随KT浓度增加呈先增大后降低的趋势。生长素IBA、IAA作用于原球茎增殖时，IBA原球茎分化为球茎效果较好。在KT 2.5mg/L+IBA 2.5mg/L组合时原球茎分化效果最佳;在山兰生根培养阶段采用6-BA 0.1mg/L+IAA 2.5mg/L的组合，其生根效果较佳，达6.6条/球茎。
总结来看山兰组培激素配比方案，可参照以下结果：
萌发培养为MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L
球茎增值培养为6-BA 5mg/L+NAA 8.0mg/L 原球莖分化培养为KT 2.5mg/L+IBA 2.5mg/L
生根培养为6-BA 0.1mg/L+IAA 2.5mg/L
4 讨论与展望
目前关于山兰的组织培养技术的研究中，关于植物生长调节剂及培养条件的分析比较常见，但就培养过程中防治污染、褐化及添加外源物质方面的资料较少。而亲缘植物杜鹃兰原球茎的抗褐化研究表明[15]，在五种抗褐化剂中，抗褐化效果依次为AC （300mg·L-1）>GSH（75mg·L-1）>Vc（50mg·L-1）>Na2S2O3（15 mg·L-1）>PVP（3000mg·L-1），此类研究，将对山兰的组织培养中有一定的借鉴和启示作用。
兰科植物组培过程当中利用较多的外源添加物质常有蛋白质、马铃薯汁、椰乳和香蕉汁等。这些物质中含有一定量激素、氨基酸和维生素及其他营养物。研究发现，这类物质对植物的组织培养有显著的促进作用。朱根发[11]等研究发现香蕉对酸碱有很强的缓冲能力，对植物的生长和增殖具有促进作用，山兰种子萌发周期较长，可加入香蕉汁，起到酸碱缓存的作用;李斌等[5]研究发现，培养基中加入香蕉有助于独蒜兰种子萌发，二人的结论相符。石丽敏等[12]研究表明，兰科种子萌发过程中不需要刻意加入外源物质，兰科药用植物种子萌发完全依赖内生真菌提供必要的碳源、氮源等多种营养物质。而在生根壮苗的过程中可加入一定的蔗糖以补充碳源，促进植物生长发育;孟肖[13]在培养基中添加番茄汁30g/L、马铃薯汁30g/L有助于白芨种子萌发并提高增殖率;李霖明[14]研究分析表明，椰汁含有某种特殊物质有助于诱导根茎出芽、提高胚的萌发率。因此在山兰组织的萌发培养中可适当添加椰汁，促进胚的萌发。在分化、生根培养阶段加入适量的蔗糖、马铃薯汁或番茄汁以补充氮源、微量元素等。此外在培养基在加入活性炭，可以有效吸附植物体的分泌物及一些有毒物质。此后的在山兰组织培养研究中，可以进一步的去探寻有机物质在组织培养在中对植物萌发、增殖、分化、生长等方面的促进作用。
朱桢煜等[4]将山兰球茎一分为二、一分为四进行组培繁殖，可以提高其繁殖系数。山兰种子小、数量多，可以提供足够的组培材料。对山兰种子进行组培繁殖将有效的提高其繁殖系数、实现短期内获取大量种苗的目标、为其规模化、集约化生产提供技术条件。山兰种子组培技术的进一步成熟，将有效的满足市场需求，同时也将对野生资源的保护作出重要贡献。
参考文献
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[4] 朱祯煜，姚百宁，马艳丽.长白山山兰繁殖技术研究[J].南方农机，2020，51（05）：20+30.
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[7] 张正海，张亚玉，孙海，等.山兰萌发种子定向培养成苗技术研究[J].特产研究，2019，41（04）：53-56+67.
[8] 王跃华，陈芳，陈燕，等.杜鹃兰种子快速萌发产生原球茎研究[J].种子，2020，39（09）：147-150.
[9] 张燕，黎斌，李思锋.不同培养基上白芨的种子萌发与幼苗形态发生[J].西北植物学报，2009，29（8）：1584-1589.
[10] 赵垚，曹小勇，杨国鹏，等.白芨种子在3种介质上萌发及生长比较[J].江苏农业科学，2021（04）：87-92.
[11] 朱根发，蒋明殿.大花蕙兰的组织培养和快速繁殖技术[J]..广东农业科学，2004（4）：36-38.
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[13] 孟肖，陈娜，张皖秋，等.外源添加物对白芨种苗生长发育状况的影响[J].江苏农业科学，2020（12）：123-128.
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