【摘 要】
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目的 建立一种检测俄亥俄等孢球虫的巢式PCR检测方法并初步用于犬球虫病的诊断. 方法 依据Gen-Bank上俄亥俄等孢球虫ITS-1基因序列设计两对特异性引物.收集俄亥俄等孢球虫卵
【机 构】
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吉林大学动物医学学院寄生虫教研室,吉林长春,130062
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目的 建立一种检测俄亥俄等孢球虫的巢式PCR检测方法并初步用于犬球虫病的诊断. 方法 依据Gen-Bank上俄亥俄等孢球虫ITS-1基因序列设计两对特异性引物.收集俄亥俄等孢球虫卵囊,采用饱和盐水漂浮法进行纯化,利用液氮一热水浴反复冻融、研磨,然后采用粪便基因组提取试剂盒提取DNA.建立巢式PCR方法,优化退火温度,并进行特异性和灵敏度检验.利用构建的巢式PCR方法对109份犬粪便样品(长春地区65份,哈尔滨地区44份)进行犬俄亥俄等孢球虫检测. 结果 构建的巢式PCR方法第二轮PCR最佳退火温度为53℃;用该方法检测犬贾第虫、阴道毛滴虫、刚地弓形虫、新孢子虫、微小隐孢子虫基因组标本均无交叉反应,检测目的核酸的最低浓度为2.05×10-12 ng/μl,较普通PCR灵敏度提高106倍.使用构建的巢式PCR方法对长春地区的65份犬粪便样品和哈尔滨地区44份犬粪便样品进行检测,阳性率分别为38.46％和6.81％. 结论 基于俄亥俄等孢球虫ITS-1基因序列建立的巢式PCR方法具有较高的灵敏度和特异度,可用于犬俄亥俄等孢球虫病的诊断和流行病学调查.
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