凉血解毒丸抗炎抗敏作用的实验研究

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  摘要:目的研究凉血解毒丸抗炎、抗敏的作用。方法采用2,4-二硝基氟苯(Dinitrofluobenzene 简称DNFB)造成变应性接触性皮炎(Allergic contact dermatitis 简称ACD)动物模型和磷酸组胺致豚鼠瘙痒模型,探讨“凉血解毒丸”的抗Ⅳ型变态反应作用。结果与模型组比较,凉血解毒丸组能显著降低2,4-二硝基氟苯所致的小鼠耳廓肿胀度,能显著抑制炎症细胞浸润和提高小鼠血清IL-10水平,差异具有统计学意义(P<0.05),但是对IFN-γ的产生无明显的影响(P>0.05);凉血解毒丸能显著止痒和增加磷酸酸组胺所致豚鼠瘙痒的致痒阈,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论凉血解毒丸对小鼠变态性接触性皮炎有效,促进抗炎因子IL-10 的产生和表达可能是其治疗机制之一,具有抗炎、抗敏的作用,无明显毒副作用。
  关键词:凉血解毒丸;抗炎;抗敏;小鼠;豚鼠
  中图分类号:R285.5文献标志码:A文章编号:1007-2349(2017)06-0068-04
  【Abstract】Objective: To study the anti-inflammatory and anti-allergic effects of Liangxue Jiedu Pill. Methods: 2, 4-dinitrofluobenzene (DNFB) was used to induce model guinea pig pruritus with allergic contact dermatitis (ACD) to study the anti-type Ⅳ allergic effect of Liangxue Jiedu Pill. Results: Compared with the model group, Liangxue Jiedu Pill group could significantly reduce the ear swelling of mice induced by 2,4-dinitrofluorobenzene, inhibit the infiltration of inflammatory cells and increase serum IL-10 level, and the difference was statistically significant (P<0.05), but there was no significant effect on the production of IFN-γ (P>0.05). Liangxue Jiedu Pill could significantly prevent itching and increase the itching threshold of histidine-induced guinea pig pruritus, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion: Liangxue Jiedu Pill is effective in mice with allergic contact dermatitis and can promote the production and expression of anti-inflammatory factor IL-10. It is one of its therapeutic mechanisms, anti-inflammatory and anti-allergic effect and no obvious side effects.
  【Key words】Liangxue Jiedu Pill, anti-inflammatory, anti-sensitive, mouse, guinea pig
  涼血解毒丸是在本院全国第三批名老中医学术经验继承工作指导老师、云南省名老中医刘复兴教授自创的皮内2号方—荆芩汤的基础上研发的中成药制剂(批号:滇药制字〈Z〉20082567A号,由云南省中医医院制剂中心生产)。该方主要由荆芥、黄芩、生地黄、牡丹皮、赤芍等药物组成,具有清热解毒、凉血止痒之功,临床主要用于治疗中医辨证属血热内蕴型的各类皮炎、湿疹及荨麻疹、药疹等多种变态反应性皮肤病[1][2]。凉血解毒丸具有明显抗炎、抗敏止痒的作用,且无明显毒副作用,然而其抗炎、抗敏的作用机理,如何延缓或控制变态反应性皮肤病的发生、发展,通过何种途径发挥作用,都尚不明确。本文通过建立2,4-二硝基氟苯(DNFB)所致的小鼠耳廓肿胀模型,观察凉血解毒丸对变应性接触性皮炎小鼠炎症细胞的抑制及对IL-10和IFN-γ表达的影响[2],通过磷酸组胺致豚鼠瘙痒模型观察其抗敏止痒的作用。从组织病理及分子生物学方面阐述其作用机制,为其临床应用提供一定的理论及实验依据,同时通过急性毒性实验,观察凉血解毒丸的毒副作用。
  1实验材料
  1.1动物昆明种小白鼠,清洁级,30只,雌雄各半,体重18-22 g,合格证号:SCXK(滇)2005-0008;合格证号:0013106,由昆明医科大学实验动物中心提供。健康豚鼠,清洁级,30只,雌雄各半,许可证号:SCXK(滇)2005-0008;合格证号:0021861。由昆明医科大学实验动物中心提供。
  1.2药物凉血解毒丸(批号:滇药制字〈Z〉20082567A号),80 g/瓶,云南省中医医院院内制剂,由云南省中医医院制剂室提供。醋酸地塞米松片,0.75 mg/片,浙江仙琚制药股份公司,国药准字:H33020822,批号:130644。0.9%氯化钠注射液,国药准字H52020069,250 mL/瓶,贵州天地药业有限责任公司出品,批号A13061504;马来酸氯苯那敏片(扑尔敏片):4 mg/片,昆明振华制药厂有限公司,批号:20130501。0.9%氯化钠注射液,国药准字H52020069,250 mL/瓶,贵州天地药业有限责任公司出品,批号A13061504。   1.3主要试剂及仪器小鼠IFN-γ ELISA 检测试剂盒、小鼠IL-10ELISA 检测试剂盒(深圳晶美生物有限公司提供);磷酸组胺:成都艾科达化学试剂有限公司生产,批号:201305011,分析纯。2,4-二硝基氟苯(DNFB):武汉福鑫化工有限公司,批号:201206012,分析纯。8mm耳肿打耳器YLS-Q4,购自山东省医学科学设备站。NewClassic MF电子分析天平:梅特勒-托利多(METTLER TOLEDO)公司生产,显微镜、酶标仪,电动剃毛器等。
  1.4给药剂量
  1.4.1凉血解毒丸剂量经人和动物的等效剂量系数换算,标准体重小鼠给药剂量为11 mg/kg;标准体重豚鼠给药剂量为5.5 mg/kg。
  1.4.2醋酸地塞米松片给药剂量参考文献[2]方法,小鼠给药剂量为0.01 g/kg。
  1.4.3扑尔敏片给药剂量参考文献[3]方法,确定豚鼠给药剂量为5.5 mg/kg。
  1.4.4急性毒性实验给药剂量凉血解毒丸分别一次给药剂量为200 mg/kg。
  1.4.5主要试剂配制以4:l的丙酮:橄榄油配成0.5%、0.2%两种浓度,现用现配。
  2实验方法
  2.1凉血解毒丸对2,4-二硝基氟苯(DNFB)所致小鼠耳廓肿胀的影响
  2.1.1实验动物分组、给药与造模[2]健康昆明种小鼠,30只,雌雄各半,随机(随机数字表法)分成3组,分别为模型空白组,阳性对照组(醋酸地塞米松组),凉血解毒丸组。除模型空白组给予等体积生理盐水外,参考文献[3]方法,阳性药组(醋酸地塞米松组)每日给药量为0.01 g/kg,凉血解毒丸组按照人和动物的等效剂量系数计算,标准体重小鼠给药剂量为11 mg/kg,每只动物按0.2 mL/10 g体质量灌胃,连续灌胃给药7 d。实验前一天在腹部固定部位3 cm×3 cm用剪刀及剃须刀去毛,实验第1、2天致敏期于去毛部位涂0.5%DNFB,每天1次,每次20 μL,第3、4、5天不涂药,第一次致敏后的第6天,用0.2%DNFB溶液20 μL涂抹在小鼠左耳两面进行免疫攻击。右耳单涂丙酮:橄榄油(4:1)溶剂作为对照;涂耳24 h后处死,沿耳廓基线剪下两耳。
  2.1.2观察指标计算诱发后左右耳组织块重量之差。
  2.1.2.1小鼠耳片重量差小鼠处死后,沿耳廓基线剪下两耳,用直径8mm的耳肿打耳器在耳中部打孔,取下相同大小的組织块,称取其重量。用分析天平称得每个组织块的重量。计算诱发后左右耳组织块重量之差。
  2.1.2.2病理变化及炎症细胞计数[4]处死小鼠后,耳部皮损组织用4%甲醛溶液固定,石蜡包埋,切片,HE 常规染色,光学显微镜下观察各组病理变化,并用网型目镜测微尺计数单 位面积真皮层最密集炎细胞浸润区的多形核细胞及单一核细胞数(个/mm2)。
  2.1.2.3检测血清IL-10、IFN-γ水平[4]实验结束后,摘除小鼠眼球,眼眶内取血,抗凝血在4℃下3000 r/min离心30 min,获取血浆,利用ELISA检测血浆中IL-10、IFN一γ的浓度。
  2.2凉血解毒丸对磷酸组织胺致痒作用的影响
  2.2.1目的了解凉血解毒丸对磷酸组织胺致痒作用的影响。
  2.2.2分组、给药、造模[5]与检测指标豚鼠30只,雌雄各半,随机(随机数字表法)分为模型组,阳性对照组(扑尔敏组),凉血解毒组。除模型组给予等体积生理盐水外,参考文献[4]方法,扑尔敏阳性对照组灌胃给予扑尔敏(0.96 mg/kg)、凉血解毒丸组给予凉血解毒丸5.5 mg/kg灌胃,每只动物按1 mL/100 g体质量灌胃.连续给药7 d。于第6天给药后剔除各组豚鼠右后足背部的毛.第7天末次给药后1 h内用砂纸分别擦伤各组豚鼠右后足背部剃毛处,面积约1 cm2。于末次给药1 h后开始分别在各组豚鼠右后足创伤处滴0.01%组胺磷酸溶液0.05 mL。此后每隔3min分别依次递增组胺的浓度(0.01%、0.02%、0.03%),每只每次滴0.05 mL,直至豚鼠出现回头舔右足时,停止实验,记录磷酸组胺的滴加次数,换算成磷酸组胺滴加总量。
  2.2.3统计方法使用SPSS18.0统计软件。计量资料均使用(x±s)表示。两独立样本的计量资料比较若呈正态分布,并具有总体方差齐性,则采用t检验,若不具有总体方差齐性,则使用t’检验。两组以上数据比较若具有总体方差齐性则采用单因素方差分析,多组数据间的两两比较使用Least-Signfieant-diffrne(LSD)方法;两组以上数据比较若不具有总体方差齐性,则使用Kruskal-Wallis H秩和检验,两两比较使用Mann-Whitney U秩和检验。以上统计方法,均以P<0.05为具有统计学意义。
  3实验结果
  3.1凉血解毒丸对2,4-二硝基氟苯(DNFB)所致小鼠耳廓肿胀的影响见表1。
  3.23组小鼠白血清IL-10水平比较见表2。
  3.33组小鼠炎症细胞计数、IFN-γ水平比较见表3。
  3.43组对磷酸组织胺致痒作用的影响见表4。
  3.5急性毒性试验对照组和凉血解毒丸组小鼠均存活,肝脏解剖未见明显异常,表明凉血解毒丸无毒副作用,安全有效。
  4讨论
  该研究通过用DNFB建立小鼠ACD模型,把小鼠耳廓作为皮炎的靶部位,通过炎症细胞计数和对细胞因子的影响来观察药物的抗炎作用。
  凉血解毒丸和醋酸地塞米松连续灌胃给药7 d后,组织学检查示凉血解毒丸和地塞米松均可明显抑制小鼠右耳中单一核细胞、中性粒细胞浸润和充血水肿,说明凉血解毒丸与醋酸地塞米松片均具有抗炎的作用,但凉血解毒丸的抗炎作用并不优于醋酸地塞米松。   在对细胞因子IL-10产生影响的实验中,阳性药地塞米松和凉血解毒丸药物均显著提高具有免疫抑制活性细胞因子IL-10的产生水平,提示地塞米松和凉血解毒丸均通过提高细胞因子IL-10的产生水平来达到抗炎的作用,但凉血解毒丸并不优于醋酸地塞米松。在对IFN-γ产生影响的实验中,地塞米松组IFN-γ产生显著减少,差异有显著性意义(P<0.01),然而凉血解毒丸对小鼠细胞因子IFN-γ产生无明显的影响(P>0.05),说明地塞米松通过降低IFN-γ的水平,进而发挥抗炎症作用,但凉血解毒丸对IFN-γ水平的影响不显著。
  在炎症过程中产生的细胞因子可分为5类,其中IL-10是免疫反应的负调节因子,能减少LPS和IFN-γ诱导的单核/巨噬细胞释放IL-6、IL-8、TNF-α等前炎性细胞因子,促进抗炎介质如可溶性TNFR的释放,还可抑制CD4+T细胞的增值和细胞因子的分泌,包括Th1生成IL-2、IFN-γ和Th2生成IL-4、IL-5,同时还可抑制中性粒细胞合成和释放促炎介质[6]。而IFN-γ属于激活巨噬细胞的细胞因子,可诱导加重炎症[1]。
  瘙痒是变态反应性皮肤疾病常见症状之一,其发病机制研究尚不完全清楚,可能与诸多因素有关,有大量研究表明,组胺是一种可以引起皮肤瘙痒的重要介质[1],主要储存在嗜碱粒细胞和肥大细胞的颗粒内。实验采用外源性组胺诱发豚鼠瘙痒的方法,与模型组比较,豚鼠局部致痒阈值明显提高(P<0.05),提示凉血解毒丸有抗瘙痒的作用。
  凉血解毒丸临床应用已10多年,现代药理学研究证明其组方中的黄芩、丹皮、赤芍、紫草、荆芥均有一定的抗炎作用,对I、II、III和Ⅳ变态反应均有抑制作用,对白介素、IFN-γ等细胞因子的表达水平均有影响[7][8],为组方的合理性提供了一定现代药理学依据,但中药复方通常作用于机体多靶点、多环节,是个复杂系统,故有必要进一步深入研究,阐明其抗炎的作用机制,并通过急性毒性试验从科学角度验证其毒副作用。
  通过以上的研究表明,凉血解毒丸具有较为明确的抗炎作用,促进抗炎因子IL-10 的产生和表达可能是其治疗机制之一;其抗敏止痒的机制可能与抑制肥大细胞脱颗释放组胺等炎症介质,产生了类似H1受体拮抗剂的作用,从而抑制了组胺与靶点的相互作用有关。
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