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摘 要：从NCBI （National Center for Biotechnology Information）中下载了蒺藜苜蓿的小RNA高通量序列和降解组测序数据，对它们分别进行归一化处理；从miRBase中下载了已知的miRNA和pre-miRNA前提信息；从plantGDB中获得蒺藜苜蓿的cDNA序列。根据小RNA高通量测序信息，与pre-miRNA进行匹配，找到miRNA candidates，对其靶基因进行预测，并利用降解组高通量测序结果和T-plot靶基因进行预测，并利用降解组高通量测序结果和T-plot作图法进行验证。获得11个具有特定功能的靶基因对应的30个新miRNA。对这些靶基因进行文献挖掘后进一步分析miRNA新基因的调控功能，结果表明，这些miRNA新基因对蒺藜苜蓿的营养摄取、生长发育和抗胁迫应答具有重要的调控作用。为深入了解蒺藜苜蓿中miRNA调控网络和调控机理提供了重要信息和理论基础。
关键词：蒺藜苜蓿，新miRNA，挖掘，靶基因，调控功能
微小RNA（microRNA，简称miRNA）是一类广泛存在于真核生物中长度约18nt～25nt的单链非编码基因家族，由茎环结构的转录前体加工而成[1～4]。自1993年Lee等人从秀丽新小杆线虫中发现了第一个小RNA lin-4 以来，miRNA调控这一崭新的领域登上了分子生物学研究的舞台[2，5]。他们普遍存在于不同的真核生物中，从四膜虫、线虫、植物、动物到人都发现了不同的miRNA，它们在调节内源基因表达，基因活动调节网络中扮演着重要的角色，在基因转录、细胞增值、细胞分化、肿瘤发生、染色体形成、RNA的剪切和修饰、病毒感染、蛋白的稳定和转运等方面起到广泛作用，对植物激素的合成，器官的形成，抗病能力的调节，适应能力的调控等生长发育过程中具有举足轻重的作用[1，3，4，6]。成熟的miRNA对与其高度互补的mRNA表达水平具有调节作用，在基因调节反面具有巨大潜力，它们通过与mRNA完全或不完全配对来影响mRNA翻译过程，直接介导RNA干扰特异性复合物（RICE）分裂切割靶mRNA，或者直接靶向切割mRNA来调节基因表达的作用-蛋白质合成水平上的作用[2]。虽然近几年不断有新的miRNA被发现的报道，但是如今发现的miRNA只不过是占未知miRNA的极少数，未知miRNA群体犹如浩瀚的宇宙，其未知的奥秘引领着人们不断发现与探索，miRNA将成为分子生物学研究的热点之一。
蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是国际上广泛用于研究仅属于豆科植物或者与之有关的某些生物过程的豆科模式植物。豆科植物作为现代农业系统发展的基础，是人类食物中蛋白质的主要来源，重要的饲料和油料作物，是生物圈中氮循环的主要氮源，它与广宿主根真菌的相互作用，可以促进植物矿物质的吸收[7]。因蒺藜苜蓿具有诸如基因组较小，遗传学简单，遗传转化相对容易，再生时间短等其它豆科无法比拟的遗传特征，蒺藜苜蓿在研究领域占据着重要地位。自2003年，国际间合作的蒺藜苜蓿基因组测序计划启动以来，蒺藜苜蓿的基因组得到广泛的研究。为了更好了解蒺藜苜蓿生理发育的作用机制，笔者利用生物信息学方法对蒺藜苜蓿miRNA进行挖掘，分析新miRNA对蒺藜苜蓿的影响，为了解蒺藜苜蓿基因内部作用机制提供有意义的信息。
一、蒺藜苜蓿中miRNA新基因的挖掘
从miRNA公共数据库miBase 21中下载了pre-miRNA和已知的miRNA序列，用于新miRNA的识别与筛选，经过pre-miRNA和测序获得的sRNA比配后，从miRNA candidates中经过一步步的miRNA筛选、靶基因预测后，通过降解组验证挖掘出30个新miRNA和对应特定功能的11个靶基因（HQ343415.1，AJ459789.1，AJ866733.1，AY389346.1，AJ1328 92.1，AY247274.1，EF468482.1，HQ721815.1，HQ721816.1，DQ666346.1和Y10455.1）。发现具有一个miRNA作用多个靶基因和多个miRNA共同作用与一个相同的靶基因模式说明miRNA和其作用的靶基因不是一一对应的。这些miRNA的共同调控作用可能是为了增强对该基因表达的调控作用。
二、miRNA新基因的调控功能
在生物技术公用数据库NCBI GEO（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中获取了蒺藜苜蓿降解组数据，被用来验证miRNA的切割位点。在PlatGDB上下载了最新测得的全部蒺藜苜蓿克隆的cDNA和mRNA（Feb，22，2012）用来识别靶基因切割位点。发现具有明确靶基因的30个miRNA中占大部分的mtr-MIR164家族共18个miRNA和mtr-MIR395a-5特异性作用于转录因子NAC1 mRNA（HQ343415.1）。有学者指出，NAC1是具有NAC功能域的转录因子，对生长素信号转录途径具有相关作用。可以预测，转录因子可能是miRNA调控蒺藜苜蓿生长发育的最主要途径之一。另外mtr-MIR2605-33，mtr-MIR2605-11作用于MYB转录因子，mtr-MIR166g-8作用于AKIN beta4（HQ343415.1）。mtr-MIR1510b产生的新miRNA中7个成员（mtr-MIR1510b-78，mtr-MIR1510b-85，mtr-MIR1510b-138，mtr-MIR1510b-95，mtr-MIR1510b-77，mtr-MIR1510b-58，mtr-MIR1510b-51）调控植物质膜H+-ATP酶基因（AJ132892.1）。有研究指出，膜H+-ATPase在植物细胞膜的物质跨膜转运、细胞的伸长生长、气孔的开闭以及植物对环境胁迫的响应等生理过程，并且可能参与根、根毛、花粉管等植物器官和组织发育过程，是植物生命活动的“主宰酶”，H+-ATPase活性调节涉及激素、环境因子等多种因素，可发生在转录、翻译和酶分子等多级水平，对植物生长发育的生理活动起重要作用[8，9，10]。以上结果表明，上述的Mtr-MIR1510所产生的新miRNA可能在蒺藜苜蓿生长发育、激素水平调节、细胞代谢等生理调控中扮演着重要的角色。Mtr-MIR2087-49共同调控着丙二烯氧化物环酶基因（AJ866733.1），葡萄糖-H+单向转运载体基因（AJ459789.1），AP2/EREBP 转录因子（DQ666346.1），htn1基因（AJ459789.1）和dihydroflavanol-4-reductase 1基因（AY389346.1）。丙二烯氧化物环化酶（Allene oxidecyclase，AOC）是调控植物发育和次生代谢的植物激素-茉莉酸（jasmonic acid，JA）生物合成途径中的一个特征酶和关键酶，在茉莉酸生物合成过程中起着重要作用，茉莉酸不但参与调节植物的生理发育过程，而且参与调节植物的防御系统，包括抵抗病原菌侵袭、干旱胁迫、渗透胁迫、机械损伤以及伤害应答等，在外界机械创伤、病虫害防御和不利的环境因子胁迫等信号转导中起信使作用，可诱导一系列植物防御基因的表达和防御反应化学物质的合成等，并调节植物的“免疫”和应激反应[11，12]。结果表明，mtr-MIR2087-49在蒺藜苜蓿免疫，抵御外界不良环境，引起植物防御应答中起重要作用。
三、结语
miRNA在植物生长发育中扮演着重要角色，它们影响着植物生长和质量。挖掘植物中新miRNA，探索miRNA的功能及其作用机制，不仅为人类深入了解植物微观世界打下基础，更为如何提高良好的生长水平打下理论基石。
参考文献
[1] 李继霞，周克元.miRNA的研究进展.生物化学与生物物理.2003，30（5）：702-705
[2] 吕德康，葛瑛，柏锡，等.生物信息学在植物miRNA研究中的应用.生物信息学，2009，7（2）：113-116
[3] 李伟，金由幸.miRNA的生物合成过程.生物化学与生物物理进展.2005，32（8）：707-711
[4] 魏强，李广林，郭韬等.miRNA-124靶标功能的生物信息学挖掘.生命科学研究.2010，14（5）：386-392
[5] 吴望军，陈杰，黄瑞华，等.高通量技术挖掘猪microRNA的研究进展.畜牧兽医学报.2013，44（12）：1857-1866
[6] 卢宝伟，苍晶.东农冬麦1号越冬期间的microRNA高通量测序及生物信息学分析.博士学位论文.哈尔滨：东北农业大学，2012
[7] 陈爱民，连瑞丽，孙杰，等.豆科模式植物—蒺藜苜蓿.植物生理学通讯.2006，42（5）：997-1003
[8] 杨颖丽，杨宁，安黎哲，等.植物质膜H+-ATPase的研究进展. 西北植物学报2006， 26（11）：2388-2396
[9] 贾毅，王伯初，王秀娟，等.植物细胞质膜H+-ATPase的调控.植物生理学通讯2002，1：98-101
[10] 邱全胜.植物细胞质膜H+-ATPase的结构和功能.植物学通报1999，16（2）：122-126
[11] 连青龙，李晓昕，钟雄辉，等.唐菖蒲丙二烯氧化物环化酶基因GhAOC的克隆与表达分析.中国农业大学学报 2012， 17（5）：46-53
[12] 蒋科技.药用植物茉莉酸合成途径关键酶基因的克隆与研究.博士论文.上海：复旦大学. 2007
关键词：蒺藜苜蓿，新miRNA，挖掘，靶基因，调控功能
微小RNA（microRNA，简称miRNA）是一类广泛存在于真核生物中长度约18nt～25nt的单链非编码基因家族，由茎环结构的转录前体加工而成[1～4]。自1993年Lee等人从秀丽新小杆线虫中发现了第一个小RNA lin-4 以来，miRNA调控这一崭新的领域登上了分子生物学研究的舞台[2，5]。他们普遍存在于不同的真核生物中，从四膜虫、线虫、植物、动物到人都发现了不同的miRNA，它们在调节内源基因表达，基因活动调节网络中扮演着重要的角色，在基因转录、细胞增值、细胞分化、肿瘤发生、染色体形成、RNA的剪切和修饰、病毒感染、蛋白的稳定和转运等方面起到广泛作用，对植物激素的合成，器官的形成，抗病能力的调节，适应能力的调控等生长发育过程中具有举足轻重的作用[1，3，4，6]。成熟的miRNA对与其高度互补的mRNA表达水平具有调节作用，在基因调节反面具有巨大潜力，它们通过与mRNA完全或不完全配对来影响mRNA翻译过程，直接介导RNA干扰特异性复合物（RICE）分裂切割靶mRNA，或者直接靶向切割mRNA来调节基因表达的作用-蛋白质合成水平上的作用[2]。虽然近几年不断有新的miRNA被发现的报道，但是如今发现的miRNA只不过是占未知miRNA的极少数，未知miRNA群体犹如浩瀚的宇宙，其未知的奥秘引领着人们不断发现与探索，miRNA将成为分子生物学研究的热点之一。
蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是国际上广泛用于研究仅属于豆科植物或者与之有关的某些生物过程的豆科模式植物。豆科植物作为现代农业系统发展的基础，是人类食物中蛋白质的主要来源，重要的饲料和油料作物，是生物圈中氮循环的主要氮源，它与广宿主根真菌的相互作用，可以促进植物矿物质的吸收[7]。因蒺藜苜蓿具有诸如基因组较小，遗传学简单，遗传转化相对容易，再生时间短等其它豆科无法比拟的遗传特征，蒺藜苜蓿在研究领域占据着重要地位。自2003年，国际间合作的蒺藜苜蓿基因组测序计划启动以来，蒺藜苜蓿的基因组得到广泛的研究。为了更好了解蒺藜苜蓿生理发育的作用机制，笔者利用生物信息学方法对蒺藜苜蓿miRNA进行挖掘，分析新miRNA对蒺藜苜蓿的影响，为了解蒺藜苜蓿基因内部作用机制提供有意义的信息。
一、蒺藜苜蓿中miRNA新基因的挖掘
从miRNA公共数据库miBase 21中下载了pre-miRNA和已知的miRNA序列，用于新miRNA的识别与筛选，经过pre-miRNA和测序获得的sRNA比配后，从miRNA candidates中经过一步步的miRNA筛选、靶基因预测后，通过降解组验证挖掘出30个新miRNA和对应特定功能的11个靶基因（HQ343415.1，AJ459789.1，AJ866733.1，AY389346.1，AJ1328 92.1，AY247274.1，EF468482.1，HQ721815.1，HQ721816.1，DQ666346.1和Y10455.1）。发现具有一个miRNA作用多个靶基因和多个miRNA共同作用与一个相同的靶基因模式说明miRNA和其作用的靶基因不是一一对应的。这些miRNA的共同调控作用可能是为了增强对该基因表达的调控作用。
二、miRNA新基因的调控功能
在生物技术公用数据库NCBI GEO（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中获取了蒺藜苜蓿降解组数据，被用来验证miRNA的切割位点。在PlatGDB上下载了最新测得的全部蒺藜苜蓿克隆的cDNA和mRNA（Feb，22，2012）用来识别靶基因切割位点。发现具有明确靶基因的30个miRNA中占大部分的mtr-MIR164家族共18个miRNA和mtr-MIR395a-5特异性作用于转录因子NAC1 mRNA（HQ343415.1）。有学者指出，NAC1是具有NAC功能域的转录因子，对生长素信号转录途径具有相关作用。可以预测，转录因子可能是miRNA调控蒺藜苜蓿生长发育的最主要途径之一。另外mtr-MIR2605-33，mtr-MIR2605-11作用于MYB转录因子，mtr-MIR166g-8作用于AKIN beta4（HQ343415.1）。mtr-MIR1510b产生的新miRNA中7个成员（mtr-MIR1510b-78，mtr-MIR1510b-85，mtr-MIR1510b-138，mtr-MIR1510b-95，mtr-MIR1510b-77，mtr-MIR1510b-58，mtr-MIR1510b-51）调控植物质膜H+-ATP酶基因（AJ132892.1）。有研究指出，膜H+-ATPase在植物细胞膜的物质跨膜转运、细胞的伸长生长、气孔的开闭以及植物对环境胁迫的响应等生理过程，并且可能参与根、根毛、花粉管等植物器官和组织发育过程，是植物生命活动的“主宰酶”，H+-ATPase活性调节涉及激素、环境因子等多种因素，可发生在转录、翻译和酶分子等多级水平，对植物生长发育的生理活动起重要作用[8，9，10]。以上结果表明，上述的Mtr-MIR1510所产生的新miRNA可能在蒺藜苜蓿生长发育、激素水平调节、细胞代谢等生理调控中扮演着重要的角色。Mtr-MIR2087-49共同调控着丙二烯氧化物环酶基因（AJ866733.1），葡萄糖-H+单向转运载体基因（AJ459789.1），AP2/EREBP 转录因子（DQ666346.1），htn1基因（AJ459789.1）和dihydroflavanol-4-reductase 1基因（AY389346.1）。丙二烯氧化物环化酶（Allene oxidecyclase，AOC）是调控植物发育和次生代谢的植物激素-茉莉酸（jasmonic acid，JA）生物合成途径中的一个特征酶和关键酶，在茉莉酸生物合成过程中起着重要作用，茉莉酸不但参与调节植物的生理发育过程，而且参与调节植物的防御系统，包括抵抗病原菌侵袭、干旱胁迫、渗透胁迫、机械损伤以及伤害应答等，在外界机械创伤、病虫害防御和不利的环境因子胁迫等信号转导中起信使作用，可诱导一系列植物防御基因的表达和防御反应化学物质的合成等，并调节植物的“免疫”和应激反应[11，12]。结果表明，mtr-MIR2087-49在蒺藜苜蓿免疫，抵御外界不良环境，引起植物防御应答中起重要作用。
三、结语
miRNA在植物生长发育中扮演着重要角色，它们影响着植物生长和质量。挖掘植物中新miRNA，探索miRNA的功能及其作用机制，不仅为人类深入了解植物微观世界打下基础，更为如何提高良好的生长水平打下理论基石。
参考文献
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