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细菌内毒素是革兰氏阴性细菌的细胞壁组分之一,当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。凝胶法测定细菌内毒素,作为《中国药典》 的“仲裁”方法,具有简单、经济、快速等特点,已成为细菌内毒素检查的常用方法。但是凝胶法是一种基于鲎试剂中的多个酶蛋白在模拟的生理环境下进行的反应,反应过程中会受到各种干扰因素的影响。
1.凝胶法细菌内毒素的检查
1.1细菌内毒素标准溶液的制备
取标准品一支,轻弹瓶壁,使粉末落入瓶底,然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕,75%酒精棉球擦拭后开启,开启过程中注意防止玻璃碎屑落入瓶内。按照标准品说明书,加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解内溶物,用封口膜将瓶口封严,置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释,制备成对应浓度的细菌内毒素标准品溶液。
1.2加入样品
取0.1ml/支的鲎试剂8支,轻弹瓶壁,使粉末落入瓶底,用砂轮在瓶颈轻轻划痕,75%酒精棉球擦拭后开启,防止玻璃碎屑落入瓶内。八支鲎试剂每两支分为一组,第一组每支加入0.2ml检查用水溶解,作为阴性对照,第二组每支先加入0.1ml检查用水溶解,后加入制备好的标准品溶液0.1ml,作为阳性对照。第三组每支先加入0.1ml检查用水溶解,后加入0.1ml的样品溶液。第四组每支先加入0.1ml的样品溶液,后加入制备好的标准品溶液0.1ml。最后分别轻轻转动瓶壁,使内容物充分溶解,避免产生气泡。
1.3孵育
加样结束后,将鲎试剂用封口膜封口,轻轻振动混匀,避免产生气泡,放入37℃±1℃恒温器中,确保安瓿瓶放入底部,保温60±2分钟。
1.4判断结果
观察并记录结果。将安瓿瓶从恒温器中轻轻取出,避免振动,每管缓缓倒转180°观察,2,4组管内形成凝胶,并且凝胶不变形,不从管壁滑脱,为阳性,1,3组未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并能从管壁滑脱,为阴性。表明该样品内毒素合格。
2.凝胶法干扰因素
2.1 鲎试剂的干扰因素
2.1.1PH值的影响
鲎试剂与内毒素的反应是一个复杂的酶促反应,鲎试剂中的酶要求PH值在6-8的范围内才能正常反应,极端的PH环境会影响酶的活性。一般来说鲎试剂配方中都添加了缓冲剂以帮助样品PH值的调节,但这不足以解决所有样品的PH值问题,会使反应受到干扰,通常表现为抑制作用。
2.1.2二价阳离子浓度不足
鲎试剂中含有必需的二价离子来保持他的灵敏度,如Mg2+离子是鲎试剂重要的辅因子,没有Mg2,离子,内毒素将无法激活鲎试剂的酶.但是许多原因会导致二价离子不足,从而抑制鲎试剂与内毒素反应的能力。
2.1.3高渗透压问题
过高浓度的盐或糖溶液通常会抑制鲎试剂反应,如50%的葡萄糖或5%的氯化钠溶液。高渗透压的溶液会从鲎试剂吸水,从而使酶失活,造成抑制,形成假阴性反应。
2.1.4酶、酶抑制剂问题
鲎试剂的凝固酶属于一种丝氨酸蛋白酶,供试品中若含有类似的丝氨酸蛋白酶会导致激活鲎试剂的反应,造成增强,形成假阳性反应。一些人血浆制品(如人血白蛋白),作为原料的血浆和血清中的丝氨酸蛋白酶可以被氧化剂、蛋白水解剂或专一失活剂所灭活,进而抑制凝固酶与内毒素的活性反应,形成抑制。
2.1.5非内毒素反应物
非内毒素反应物不是内毒素,不会引起热原反应,但它会激活鲎试剂中的G因子形成反应,在一些样品中虽然内毒素含量并未超过限定值,但是内毒素检查呈现假阳性。葡聚糖是造成内毒素检查结果假阳性的一个已知来源。日常使用的酒精棉、纱布、含糖大输液、纤维素类制品等都会带来含有β-葡聚糖的成分。
2.2.内毒素的干扰因素
2.2.1内毒素的聚集及吸附的干扰
内毒素标准品是提纯的内毒素,外表没有包裹,杂质很少,因此没有自然存在的内毒素稳定,溶解后放置时间太长,会失活造成效价下降。内毒素分子是一个具有亲水,疏水两个区域的两性分子,这种结构使其容易自身聚集成团,成为更大的分子,随着内毒素分子的聚集增加,内毒素的鲎反应性和热原性都显著下降。内毒素的吸附作用表现在实验器具上,应首选硼硅酸盐玻璃的稀释管、反应管、刻度吸管,尽可能不要用聚丙烯材料,它会加剧内毒素的损耗。
2.2.2脂质体问题
脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,由于其具有两亲性因而会使其对一些具有疏水集团的产品有亲和力(如脂蛋白、大分子量血浆蛋白),脂多糖与这些产品的结合会使其大小和形状受到影响,进而影响活性,使内毒素试验受到干扰,形成抑制作用
2.2.3洗涤剂表面活性剂
实验器具上残留的洗涤剂作用于鲎试剂和内毒素,对实验结果产生影响。高浓度的洗涤剂会使鲎试剂失活,形成假阴性。弱的非离子型表面活性剂和其它阳离子洗涤剂会分解内毒素的三维结构,使内毒素变成小分子,毒性中心暴露面积增加从而增加其效价,形成增强作用。
综上所述,凝胶法细菌内毒素的干扰有两个方面,一个是鲎试剂的干扰,一个是内毒素的干扰,实验过程中要注意这些干扰的影响,大部分干扰问题可以通过稀释供试品的方法去除。但同时注意不能影响供试品中的内毒素活性是消除干扰的一个重要原则。
参考文献
[1]黄清泉,夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志,1997,32(2):72.
[2]国家药典委员会.中国药典,Ⅱ 部[ S].北京:化学工业出版社,2000:附录 86
[3]中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典,Ⅱ 部[ S].北京:化学工业出版社,1995:附录 XXⅢ.
[4]黄冬,房判石,金燕辛,等赏试剂法检测细菌内毒素假阳性原因浅析[ J].首都医药,2000,7(5):53-54
[5]张媛,苏杰.浅析细菌内毒素检查法的干扰因素[J].中国兽药杂志,2002,36(3):51-52
[6]郭录平.浅谈影响鲎试验的因素[ J].中国药学杂志,1996,31(3):187
[7]周國英.内毒素同鲎试剂的蛋白凝固反应生化机理.见:吴伟洪主编.鲎与鲎试验法论文汇编.厦门:厦门市医药研究所鲎研室出版,1983:47~61.
[8]吴文飞.3种无菌冲洗剂细菌内毒素检查方法初探[J].中国药房,2007,18(16:1262-1264)
作者简介
王震(1985-4),男,天津市人,民族:汉职称:助理工程师,学历:本科。研究方向:间充质干细胞注射液,免疫细胞。
(作者单位:中源协和生物细胞存储服务(天津)有限公司)
1.凝胶法细菌内毒素的检查
1.1细菌内毒素标准溶液的制备
取标准品一支,轻弹瓶壁,使粉末落入瓶底,然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕,75%酒精棉球擦拭后开启,开启过程中注意防止玻璃碎屑落入瓶内。按照标准品说明书,加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解内溶物,用封口膜将瓶口封严,置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释,制备成对应浓度的细菌内毒素标准品溶液。
1.2加入样品
取0.1ml/支的鲎试剂8支,轻弹瓶壁,使粉末落入瓶底,用砂轮在瓶颈轻轻划痕,75%酒精棉球擦拭后开启,防止玻璃碎屑落入瓶内。八支鲎试剂每两支分为一组,第一组每支加入0.2ml检查用水溶解,作为阴性对照,第二组每支先加入0.1ml检查用水溶解,后加入制备好的标准品溶液0.1ml,作为阳性对照。第三组每支先加入0.1ml检查用水溶解,后加入0.1ml的样品溶液。第四组每支先加入0.1ml的样品溶液,后加入制备好的标准品溶液0.1ml。最后分别轻轻转动瓶壁,使内容物充分溶解,避免产生气泡。
1.3孵育
加样结束后,将鲎试剂用封口膜封口,轻轻振动混匀,避免产生气泡,放入37℃±1℃恒温器中,确保安瓿瓶放入底部,保温60±2分钟。
1.4判断结果
观察并记录结果。将安瓿瓶从恒温器中轻轻取出,避免振动,每管缓缓倒转180°观察,2,4组管内形成凝胶,并且凝胶不变形,不从管壁滑脱,为阳性,1,3组未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并能从管壁滑脱,为阴性。表明该样品内毒素合格。
2.凝胶法干扰因素
2.1 鲎试剂的干扰因素
2.1.1PH值的影响
鲎试剂与内毒素的反应是一个复杂的酶促反应,鲎试剂中的酶要求PH值在6-8的范围内才能正常反应,极端的PH环境会影响酶的活性。一般来说鲎试剂配方中都添加了缓冲剂以帮助样品PH值的调节,但这不足以解决所有样品的PH值问题,会使反应受到干扰,通常表现为抑制作用。
2.1.2二价阳离子浓度不足
鲎试剂中含有必需的二价离子来保持他的灵敏度,如Mg2+离子是鲎试剂重要的辅因子,没有Mg2,离子,内毒素将无法激活鲎试剂的酶.但是许多原因会导致二价离子不足,从而抑制鲎试剂与内毒素反应的能力。
2.1.3高渗透压问题
过高浓度的盐或糖溶液通常会抑制鲎试剂反应,如50%的葡萄糖或5%的氯化钠溶液。高渗透压的溶液会从鲎试剂吸水,从而使酶失活,造成抑制,形成假阴性反应。
2.1.4酶、酶抑制剂问题
鲎试剂的凝固酶属于一种丝氨酸蛋白酶,供试品中若含有类似的丝氨酸蛋白酶会导致激活鲎试剂的反应,造成增强,形成假阳性反应。一些人血浆制品(如人血白蛋白),作为原料的血浆和血清中的丝氨酸蛋白酶可以被氧化剂、蛋白水解剂或专一失活剂所灭活,进而抑制凝固酶与内毒素的活性反应,形成抑制。
2.1.5非内毒素反应物
非内毒素反应物不是内毒素,不会引起热原反应,但它会激活鲎试剂中的G因子形成反应,在一些样品中虽然内毒素含量并未超过限定值,但是内毒素检查呈现假阳性。葡聚糖是造成内毒素检查结果假阳性的一个已知来源。日常使用的酒精棉、纱布、含糖大输液、纤维素类制品等都会带来含有β-葡聚糖的成分。
2.2.内毒素的干扰因素
2.2.1内毒素的聚集及吸附的干扰
内毒素标准品是提纯的内毒素,外表没有包裹,杂质很少,因此没有自然存在的内毒素稳定,溶解后放置时间太长,会失活造成效价下降。内毒素分子是一个具有亲水,疏水两个区域的两性分子,这种结构使其容易自身聚集成团,成为更大的分子,随着内毒素分子的聚集增加,内毒素的鲎反应性和热原性都显著下降。内毒素的吸附作用表现在实验器具上,应首选硼硅酸盐玻璃的稀释管、反应管、刻度吸管,尽可能不要用聚丙烯材料,它会加剧内毒素的损耗。
2.2.2脂质体问题
脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,由于其具有两亲性因而会使其对一些具有疏水集团的产品有亲和力(如脂蛋白、大分子量血浆蛋白),脂多糖与这些产品的结合会使其大小和形状受到影响,进而影响活性,使内毒素试验受到干扰,形成抑制作用
2.2.3洗涤剂表面活性剂
实验器具上残留的洗涤剂作用于鲎试剂和内毒素,对实验结果产生影响。高浓度的洗涤剂会使鲎试剂失活,形成假阴性。弱的非离子型表面活性剂和其它阳离子洗涤剂会分解内毒素的三维结构,使内毒素变成小分子,毒性中心暴露面积增加从而增加其效价,形成增强作用。
综上所述,凝胶法细菌内毒素的干扰有两个方面,一个是鲎试剂的干扰,一个是内毒素的干扰,实验过程中要注意这些干扰的影响,大部分干扰问题可以通过稀释供试品的方法去除。但同时注意不能影响供试品中的内毒素活性是消除干扰的一个重要原则。
参考文献
[1]黄清泉,夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志,1997,32(2):72.
[2]国家药典委员会.中国药典,Ⅱ 部[ S].北京:化学工业出版社,2000:附录 86
[3]中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典,Ⅱ 部[ S].北京:化学工业出版社,1995:附录 XXⅢ.
[4]黄冬,房判石,金燕辛,等赏试剂法检测细菌内毒素假阳性原因浅析[ J].首都医药,2000,7(5):53-54
[5]张媛,苏杰.浅析细菌内毒素检查法的干扰因素[J].中国兽药杂志,2002,36(3):51-52
[6]郭录平.浅谈影响鲎试验的因素[ J].中国药学杂志,1996,31(3):187
[7]周國英.内毒素同鲎试剂的蛋白凝固反应生化机理.见:吴伟洪主编.鲎与鲎试验法论文汇编.厦门:厦门市医药研究所鲎研室出版,1983:47~61.
[8]吴文飞.3种无菌冲洗剂细菌内毒素检查方法初探[J].中国药房,2007,18(16:1262-1264)
作者简介
王震(1985-4),男,天津市人,民族:汉职称:助理工程师,学历:本科。研究方向:间充质干细胞注射液,免疫细胞。
(作者单位:中源协和生物细胞存储服务(天津)有限公司)