论文部分内容阅读
目的 构建携带小鼠SOCS1基因沉默重组慢病毒载体,鉴定其在小鼠树突状细胞系(DC2.4)中SOCS1基因的表达并筛选稳定沉默表达SOCS1基因的小鼠树突状细胞系. 方法 根据小鼠SOCS1基因筛选相应靶序列,与表达载体pYr-Lvsh连接后转化感受态DH5α细胞,挑取细胞克隆进行酶切及测序鉴定,鉴定正确的载体转染293FT细胞,进行慢病毒包装及滴度测定.将包装的慢病毒PLV-musSOCS1-shRNA转染DC2.4细胞系,通过荧光显微镜、流式细胞仪及real-time PCR检测DC2.4细胞中SOCS1基因的表达,通过台盼蓝染色检测转染后细胞活性. 结果 表达载体pYr-Lvsh测序显示引物完全连接到载体上.将测序所得序列与引物比对,PLV-musSOCS1-sh构建成功.扩增后检测慢病毒滴度约为4×109 TU/ml.慢病毒转染24 h后荧光显微镜下可见少量表达绿色荧光的DC2.4细胞,且随着时间的延长,转染成功的细胞逐渐增多,细胞内荧光强度渐次增强,48 h后表达量明显增多,72 h后更加明显.经流式细胞仪检测,转染48 h及72 h细胞绿色荧光表达率均达100％.对照组的细胞活性为(92.27±0.80)％,转染组转染后48h的细胞活性为(88.40±0.92)％,差异有统计学意义(t=5.499,P＜0.01);转染组转染后72 h的细胞活性为(44.97±3.70)％,与对照组及48 h转染组比较差异有统计学意义(t值分别为21.637和19.733,P＜0.01).real-time PCR检测,转染组SOCS1基因相对表达量较空病毒载体对照组下调约75.3％(t=-10.179,P＜0.01). 结论 构建的慢病毒PLV-musSOCS1-shRNA在DC2.4细胞中成功沉默SOCS1基因并稳定表达,成功筛选出低表达SOCS1基因的小鼠树突状细胞系,为通过SOCS1基因沉默调控DC免疫状态抗真菌感染免疫等相关研究奠定了基础.