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摘 要：为了分析在同一个实验室的2台不同型号的实时荧光定量PCR仪（扩增曲线和标准曲线的相关参数）可比性，在常规条件下，使用同一批号的试剂，将标准品及同一水稻种子样品TT51-1在2台荧光定量PCR仪上进行扩增，对标准曲线的参数及分析结果进行比对，分析其一致性。结果表明，作为单一的检测系统，运用同一批号试剂对相同标准品及待检样品的试验中，2台实时荧光定量PCR仪测定的结果差异没有统计学意义（P > 0.05）。通过对标准曲线的相关参数和待检测样品的检测结果的分析，可以判定实验室存在的2台实时荧光定量PCR仪检测的结果的一致性，可确保检测结果可靠。
关键词：TT51-1水稻;标准曲线;转基因成分检测;实时荧光定量PCR;可靠性分析
中图分类号：S-3
文献标识码：A
DOI：10.19754/j.nyyjs.20190830004
基金项目：山西省高等学校教学改革创新项目“开放式生物技术专业实践教学体系的研究与实践”（项目编号：J2018079）;山西农业大学科技创新基金资助“基于DNA甲基化探究双酚A致Marc-145细胞毒性机制”（项目编号：2016ZZ09）; 山西省科技攻关项目“主要转基因深加工农产品定量检测技术研究”（项目编号：20140311025-3）
实时荧光定量PCR技术在诸多领域都得到了广泛应用，其领域涉及动物学、植物学、环境生物学和医药卫生等[1-3]。由于实时荧光定量PCR技术只要设计出能够对应检测样品的引物与探针，就能够实现特异性地结合的特点，也被广泛地运用在对环境中的微生物变化进行检测的方面[4-8]。虽然实时荧光定量技术拥有很强的特异性，很好的重复性，较高的自动化程度以及较快的检测速度，但是影响实时荧光定量PCR技术的因素仍旧不能忽视。样品的处理、试剂的选择与储存、核酸的提取、仪器的扩增、操作的规范性以及对于结果的分析都是可能影响到试验的最终结果的因素[9-12]。对于实验过程之中可能对于实验结果造成影响的因素进行分析，对应寻找合适的解决措施与方法，可以提高检验检疫的精确度。特别是随着分子生物学的发展和分子生物学研究手段在检测领域的运用，同一实验室内有多台实时荧光定量PCR仪的情况变得越来越常见。判断2台实时荧光定量PCR仪扩增与检测结果的一致性，是实现实验室的规范标准化亟待解决的问题。为此，本试验在同一条件下，将100% TT51-1水稻标准物质和待测样品（1% TT51-1水稻标准物质）在2台实时荧光定量PCR仪上由同一操作人员使用相同试剂进行扩增，对标准曲线的相关参数和检测结果进行分析，以此记录和比照不同仪器的检测结果是否具有的一致性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 水稻材料
1% TT51-1水稻标准物质作为待测样品、100% TT51-1水稻标准物质作为阳性标准品（均由农业农村部科技发展中心提供）。
1.1.2 主要試剂
植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（DP130227，TIANFGEN（BEIJING） CO.LTD）、无水乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、β-巯基乙醇、适用于实时荧光定量的TaqDNA聚合酶以及缓冲液、dNTP等实验室常规分析纯试剂。
1.1.3 主要仪器
试验中所用2台实时荧光定量PCR仪，见表1。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取及纯化
本试验参照植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）说明书进行提取基因组DNA。
1.2.2 DNA溶液的浓度和纯度
开启核酸蛋白定量检测仪，用10μL移液器将2μL TE加入到测量孔中进行调零。
将2μL提纯的DNA溶液加到测量孔，检测DNA浓度，记录结果，清洗测量杯，重复检测DNA浓度3次并计算平均值。
1.2.3 样品制备
初始模版的制备：将提取好并检测浓度后的 DNA 溶液用灭菌的超纯水稀释至50ng/μL来作为初始的模板。
浓度梯度溶液的制备：用灭菌的超纯水对初始模板进行梯度稀释，分别为10ng/μL、2ng/μL、0.4ng/μL、0.08ng/μL。
1.3 实时荧光定量PCR检测
对样品进行实时荧光定量PCR，检测对象为水稻转化体TT51-1和PLD基因。阳性标准品为100%的水稻标准物质，阴性对照为鲑鱼精子DNA，空白对照是灭菌的ddH2O。检测方法和引物探针参照农业部2122号公告-8-2014[13]。
1.3.1 实时荧光定量 PCR 所用的引物与探针
实时荧光定量 PCR 所用的引物和探针见表2。
1.3.2 实时荧光定量PCR反应体系
试验中TT51-1荧光定量PCR体系见表3，PLD荧光定量PCR体系见表4。
1.3.3 实时荧光定量PCR循环参数
实时荧光定量PCR体系见表5[14-16]。
2 结果与分析
2.1 样品DNA含量检测结果
100% TT51-1水稻标准物质的基因组DNA浓度和纯度检测结果，见表6。
提取100% TT51-1水稻标准物质的基因组DNA的浓度为538.5ng/μL，在25ng/μL以上，OD260/OD280为1.86，在1.7～2.0之间;OD260/OD230为2.04，大于2，说明所提取的DNA浓度与纯度均符合实时荧光定量PCR的要求。
2.2 实时荧光定量PCR对于样品的检测结果（机型Ⅰ）
2.2.1TT51-1实时荧光定量PCR检测标准曲线 100%TT51-1水稻标准物质DNA在机型Ⅰ上的标准曲线如图1所示。
从图1可以看出，TT51-1扩增效率为103.3%，R2为0.994
关键词：TT51-1水稻;标准曲线;转基因成分检测;实时荧光定量PCR;可靠性分析
中图分类号：S-3
文献标识码：A
DOI：10.19754/j.nyyjs.20190830004
基金项目：山西省高等学校教学改革创新项目“开放式生物技术专业实践教学体系的研究与实践”（项目编号：J2018079）;山西农业大学科技创新基金资助“基于DNA甲基化探究双酚A致Marc-145细胞毒性机制”（项目编号：2016ZZ09）; 山西省科技攻关项目“主要转基因深加工农产品定量检测技术研究”（项目编号：20140311025-3）
实时荧光定量PCR技术在诸多领域都得到了广泛应用，其领域涉及动物学、植物学、环境生物学和医药卫生等[1-3]。由于实时荧光定量PCR技术只要设计出能够对应检测样品的引物与探针，就能够实现特异性地结合的特点，也被广泛地运用在对环境中的微生物变化进行检测的方面[4-8]。虽然实时荧光定量技术拥有很强的特异性，很好的重复性，较高的自动化程度以及较快的检测速度，但是影响实时荧光定量PCR技术的因素仍旧不能忽视。样品的处理、试剂的选择与储存、核酸的提取、仪器的扩增、操作的规范性以及对于结果的分析都是可能影响到试验的最终结果的因素[9-12]。对于实验过程之中可能对于实验结果造成影响的因素进行分析，对应寻找合适的解决措施与方法，可以提高检验检疫的精确度。特别是随着分子生物学的发展和分子生物学研究手段在检测领域的运用，同一实验室内有多台实时荧光定量PCR仪的情况变得越来越常见。判断2台实时荧光定量PCR仪扩增与检测结果的一致性，是实现实验室的规范标准化亟待解决的问题。为此，本试验在同一条件下，将100% TT51-1水稻标准物质和待测样品（1% TT51-1水稻标准物质）在2台实时荧光定量PCR仪上由同一操作人员使用相同试剂进行扩增，对标准曲线的相关参数和检测结果进行分析，以此记录和比照不同仪器的检测结果是否具有的一致性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 水稻材料
1% TT51-1水稻标准物质作为待测样品、100% TT51-1水稻标准物质作为阳性标准品（均由农业农村部科技发展中心提供）。
1.1.2 主要試剂
植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（DP130227，TIANFGEN（BEIJING） CO.LTD）、无水乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、β-巯基乙醇、适用于实时荧光定量的TaqDNA聚合酶以及缓冲液、dNTP等实验室常规分析纯试剂。
1.1.3 主要仪器
试验中所用2台实时荧光定量PCR仪，见表1。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取及纯化
本试验参照植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）说明书进行提取基因组DNA。
1.2.2 DNA溶液的浓度和纯度
开启核酸蛋白定量检测仪，用10μL移液器将2μL TE加入到测量孔中进行调零。
将2μL提纯的DNA溶液加到测量孔，检测DNA浓度，记录结果，清洗测量杯，重复检测DNA浓度3次并计算平均值。
1.2.3 样品制备
初始模版的制备：将提取好并检测浓度后的 DNA 溶液用灭菌的超纯水稀释至50ng/μL来作为初始的模板。
浓度梯度溶液的制备：用灭菌的超纯水对初始模板进行梯度稀释，分别为10ng/μL、2ng/μL、0.4ng/μL、0.08ng/μL。
1.3 实时荧光定量PCR检测
对样品进行实时荧光定量PCR，检测对象为水稻转化体TT51-1和PLD基因。阳性标准品为100%的水稻标准物质，阴性对照为鲑鱼精子DNA，空白对照是灭菌的ddH2O。检测方法和引物探针参照农业部2122号公告-8-2014[13]。
1.3.1 实时荧光定量 PCR 所用的引物与探针
实时荧光定量 PCR 所用的引物和探针见表2。
1.3.2 实时荧光定量PCR反应体系
试验中TT51-1荧光定量PCR体系见表3，PLD荧光定量PCR体系见表4。
1.3.3 实时荧光定量PCR循环参数
实时荧光定量PCR体系见表5[14-16]。
2 结果与分析
2.1 样品DNA含量检测结果
100% TT51-1水稻标准物质的基因组DNA浓度和纯度检测结果，见表6。
提取100% TT51-1水稻标准物质的基因组DNA的浓度为538.5ng/μL，在25ng/μL以上，OD260/OD280为1.86，在1.7～2.0之间;OD260/OD230为2.04，大于2，说明所提取的DNA浓度与纯度均符合实时荧光定量PCR的要求。
2.2 实时荧光定量PCR对于样品的检测结果（机型Ⅰ）
2.2.1TT51-1实时荧光定量PCR检测标准曲线 100%TT51-1水稻标准物质DNA在机型Ⅰ上的标准曲线如图1所示。
从图1可以看出，TT51-1扩增效率为103.3%，R2为0.994