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摘要 目的:观察人参皂苷Rb1是否通过调节沉默信息调节因子1(SIRT1)表达抗晶状体上皮细胞衰老。方法:构建晶状体上皮细胞株SRA01/04衰老模型,加入人参皂苷Rb1培养后通过PCR检测SIRT1的表达改变,通过β-半乳糖苷酶染色检测衰老情况。敲降正常晶状体上皮细胞株SRA01/04中SIRT1的表达后检测衰老情况,再次加入人参皂苷Rb1后通过PCR和免疫荧光观察上述指标有无改变。结果:60 μmol/L人参皂苷Rb1处理衰老SRA01/04细胞内SIRT1表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);SIRT1沉默后,SRA01/04细胞衰老程度明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与SIRT1沉默组比较,SIRT1沉默同时加入人参皂苷Rb1后,SIRT1有所上升。结论:人参皂苷Rb1可以通过调节SIRT1表达抗晶状体上皮细胞衰老。
关键词 年龄相关性白内障;晶状体上皮细胞;人参皂苷Rb1;沉默信息调节因子1;细胞衰老;凋亡;炎证;氧化损伤
Abstract Objective:To observe whether ginsenoside Rb1 can inhibit senescence of lens epithelial cells by regulating expression of SIRT1.Methods:Senescence model of lens epithelial cell line SRA01/04 was established,and cultured with adding ginsenoside Rb1.The mRNA expression of SIRT1 was detected by PCR and the degree of senescence were detected by β-galactosidase staining positive rate.The expression of SIRT1 in the normal lens epithelial cell line SRA01/04 was knocked down to detect aging,and then ginsenoside Rb1 was added again to observe whether the above indicators have changed by PCR and immunofluorescence.Results:60 μmol/L ginsenoside Rb1 treatment of senescent SRA01/04 cells increased the expression of SIRT1 (P<0.05); after silencing SIRT1,SRA01/04 cells senescence significantly increased (P<0.05); compared with the silence SIRT1 group,after silencing SIRT1 simultaneously adding ginsenoside Rb1,SIRT1 increased.Conclusion:Ginsenoside Rb1 can resist the senescence of lens epithelial cells by regulating the expression of SIRT1.
Keywords Age-related Cataract; Lens Epithelial Cells; Ginsenoside Rb1;SIRT1; Cell senescence; Apoptosis; Inflammation; Oxidative damage
中圖分类号:R284文献标识码:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.013
年龄相关性白内障(Age-related Cataract,ARC)是我国乃至全球范围内首位致盲性眼病[1]。随着社会的老龄化增加,ARC的患病率也随之增高,将成为社会的一大经济负担。尽管手术仍然是唯一有效的白内障治疗方法,但仍存在术后近远期的并发症[2]。因此研究ARC的病因和发病机制用于指导临床药物开发对其防治有着重要意义。ARC是复杂性多因素疾病,是环境和遗传因素共同作用下的结果。晶状体上皮细胞(Lens Epithelial Cells,LECs)是晶状体的代谢活跃中心,是ARC病理生理过程的关键细胞。目前普遍认为LECs的氧化损伤导致细胞衰老是ARC发生发展最重要的因素[3]。
沉默信息调节因子1(Silent Information Regulation 1,SIRT1)是一种参与调控细胞衰老的高度保守的生物酶,被称为“抗衰老酶”。SIRT1通过结合P53蛋白并使去乙酰化从而负性调节其活性减缓细胞衰老[4]。SIRT1还参与调节转录因子FOXO1的活性等细胞衰老相关信号通路[5]。
人参皂苷Rb1是人参中含量最多的成分,在调节机体免疫力、抗炎、抗氧化、抗衰老等方面发挥着重要作用。已有研究报告显示人参皂苷Rb1可通过SIRT1/核因子κB信号通路抑制高糖处理的H9C2细胞的凋亡与炎症反应[6],可以通过调控SIRT1/eNOS/NO信号通路抵抗人脐静脉内皮细胞衰老[7],还可以通过调控MAPK/PKA-LKB1细胞信号通路抑制紫外线诱导的细胞增殖[8]。本研究拟建立晶状体上皮细胞SRA01/04衰老模型,探讨人参皂苷Rb1是否能够延缓SRA01/04细胞衰老,并从调控SIRT1作用方面探讨人参皂苷Rb1对晶状体上皮抗衰老方面的影响。
1 材料与方法 1.1 材料
1.1.1 细胞 细胞采用人类晶状体上皮细胞株SRA01/04,购自中国科学院。
1.1.2 药物 人参皂苷Rb1购自普菲德(中国成都)。
1.1.3 试剂与仪器 人参皂苷Rb1(普菲德公司,成都,货号:41753-43-9);胎牛血清(GIBCO公司,澳洲,货号:10099-141);TRIzol试剂(Invitrogen公司,美国,货号:15596026);转染试剂盒(Invitrogen公司,美国,货号:11668-027);逆转录试剂盒(TaKaRa公司,日本,货号:RR036A);荧光定量试剂盒(Thermos fisher公司,美国,货号:4376598);兔抗SIRT1、GAPDH多克隆抗体(Abcam公司,美国,货号:ab189494,ab9485);SIRT1小干扰RNA(siSIRT1,锐博生物科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 将SRA01/04衰老模型分为对照组;20 μmol/L;40 μmol/L;60 μmol/L和80 μmol/L人参皂苷Rb1组。常规培养SRA01/04细胞传至2~3代后,按每孔5×105个细胞接种至24孔板中。加入50 μmol/L的过氧化氢(H2O2),继续培养后收取细胞。进行细胞形态、衰老相关β-半乳糖苷酶(Senescenceβ-Galactosidase)染色,当染色比较稳定时,即为本实验中SRA01/04细胞的衰老模型。
1.2.2 给药方法 将不同浓度的人参皂苷Rb1分别加入细胞培养液中,同等条件下培养48 h后观察细胞形态及β-半乳糖苷酶染色阳性率选择最宜浓度。
1.2.3 检测指标与方法
1)探讨人参皂苷Rb1抗SRA01/04细胞衰老的最佳浓度:
将不同浓度的人参皂苷Rb1分别加入细胞培养液中,同等条件下培养48 h后观察细胞形态及β-半乳糖苷酶染色阳性率选择最宜浓度。
2)探讨人参皂苷Rb1抗SRA01/04细胞衰老的机制:
在SRA01/04细胞生长至60%~70%时进行转染。分为对照组、siSIRT1组、人参皂苷Rb1组、siSIRT1+人参皂苷Rb1组。转染后加入80 μmol/L人参皂苷Rb1继续培养。各组在相同培养时间后,检测SIRT1的表达。RNA干扰序列是由锐博生物科技有限公司设计合成。
3)qRT-PCR法检测SIRT1表达量:
用TRIzol法提取各组细胞的RNA,测定RNA的纯度和浓度;按照TaKaRa试剂盒说明书逆转录为cDNA。选取SIRT1(assay ID:Hs01009006_m1),以人GAPDH(Hs02786624_g1)作為内参,加入TaqMan Expression Master Mix(Thermos fisher),用ABI公司的step-one型实时PCR仪分析,通过检测荧光信号,比较SIRT1和内参基因的Ct值,最后用2-△△Ct分析相关基因的表达情况。该实验对每个样本重复做3次。
4)免疫荧光:
在培养板中加入小圆片用于细胞爬片,经过4%的多聚甲醛固定,0.5%Triton X-100室温通,BSA室温封闭后,每张小圆片滴加50 μL一抗,放入湿盒4 ℃过夜。PBS清洗,擦干多余液体,滴加荧光二抗,放入湿盒室温孵育1 h,PBS浸洗,滴加Hochest进行染核,PBS清洗。封片后在荧光显微镜下采集图像。
1.3 统计学方法
采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析,计量资料采用均数±标准差(±s)表示,组间以单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SRA01/04细胞衰老模型的建立与验证
加入H2O2组衰老模型组的细胞形态由短胖变细长,并出现生长缓慢、贴壁细胞减少等衰老改变。见图1。
2.2 人参皂苷Rb1抗衰老的最佳浓度
在SRA01/04细胞衰老模型中加入不同浓度(20、40、60和80 μmol/L)的人参皂苷Rb1进行培养,48 h后观察β-半乳糖苷酶染色情况。结果显示,与对照组(0 μmol/L)比较,加入了人参皂苷Rb1的SRA01/04细胞,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),其中以60 μmol/L组效果最佳。见图2。
2.3 人参皂苷Rb1通过SIRT1抗SRA01/04细胞衰老
分为正常SRA01/04细胞组,SRA01/04衰老模型组,加入不同浓度(20、40、60和80 μmol/L)人参皂苷Rb1组。提取各组总RNA并检测SIRT1的表达。结果显示除了正常SRA01/04细胞中SIRT1最高外,与不加入人参皂苷Rb1组比较,加入了人参皂苷Rb1的衰老模型SRA01/04细胞SIRT1的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),以60 μmol/L人参皂苷Rb1组最明显。见图3。
2.4 免疫荧光验证人参皂苷Rb1通过SIRT1抗SRA01/04细胞衰老
检测SRA01/04衰老模型及同时加入60 μmol/L人参皂苷Rb1后SIRT1中的表达。与不加入人参皂苷Rb1组比较,加入人参皂苷Rb1组(60 μmol/L)SIRT1比SRA01/04衰老模型高。见图4。
2.5 沉默SIRT1以及同时加入人参皂苷Rb1对SIRT1表达的影响
SIRT1沉默后SIRT1水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);加入60 μmol/L人参皂苷Rb1后,SIRT1升高,但差异无统计学意义(P>0.05);同时SIRT1沉默及加入60 μmol/L人参皂苷Rb1组的SIRT1水平仅表现为轻度降低,较SIRT1沉默组明显提高。见图5。 3 讨论
ARC的病因和发病机制至今仍不清楚。目前手术仍是主要治疗手段,但手术远期效果不佳[9]。因此研究其病因和发病机制用于指导药物开发对ARC的防治有着重要意义。在众多ARC病因的假说中,LECs的DNA氧化损伤假说较为公认[3,10-11]。紫外线和过氧化氢(H2O2)等外源性刺激可以引起DNA损伤,同时,可诱导细胞衰老,导致年龄相关性疾病的发生[12-14]。目前关于衰老的学说有很多种,最常见的包括自由基、DNA损伤、端粒酶和炎症反应。SIRT1可通过参多种途径参与抗细胞衰老,包括调节代谢和炎症反应等[15-17]。本研究发现,60 μmol/L人参皂苷Rb1能明显上调SIRT1表达,延缓晶状体上皮细胞衰老。
在中国,人参历来被视为百草之王,其应用已有数千年。中医认为,人参具有大补元气,复脉固脱,补脾益肺,生津,安神等作用。有研究发现,人参药理作用主要包括调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老、抵抗疲劳等,临床应用广泛,同时也可用于强身固本[18]。而人参皂苷是从人参中提炼而来,被视为人参中最重要的活性成分,因其多方面的药理作用,成为了热门的研究对象。研究已发现人参皂苷在多种细胞中均具有延缓衰老作用[19-22]。本实验研究结果显示,SRA01/04细胞衰老模型中,SIRT1表达减少,人参皂苷Rb1干预后,SIRT1表达增加,而β-半乳糖苷酶染色阳性率降低;SIRT1沉默后发现,SIRT1表达明显减少;然而,在SIRT1沉默同时加用人参皂苷Rb1,SIRT1未发生明显减少。从正反两面说明,人参皂苷Rb1可以上调SIRT1表达,延缓SRA01/04细胞衰老。
本研究探讨了人参皂苷Rb1延缓SRA01/04细胞衰老的可能机制,结果表明人参皂苷Rb1可通过调控SIRT1延缓SRA01/04细胞衰老。但研究仍然停留在细胞层面,需要进一步在体内实验进行论证,最终用于临床防治ARC。
参考文献
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(2019-05-19收稿 責任编辑:杨觉雄)
关键词 年龄相关性白内障;晶状体上皮细胞;人参皂苷Rb1;沉默信息调节因子1;细胞衰老;凋亡;炎证;氧化损伤
Abstract Objective:To observe whether ginsenoside Rb1 can inhibit senescence of lens epithelial cells by regulating expression of SIRT1.Methods:Senescence model of lens epithelial cell line SRA01/04 was established,and cultured with adding ginsenoside Rb1.The mRNA expression of SIRT1 was detected by PCR and the degree of senescence were detected by β-galactosidase staining positive rate.The expression of SIRT1 in the normal lens epithelial cell line SRA01/04 was knocked down to detect aging,and then ginsenoside Rb1 was added again to observe whether the above indicators have changed by PCR and immunofluorescence.Results:60 μmol/L ginsenoside Rb1 treatment of senescent SRA01/04 cells increased the expression of SIRT1 (P<0.05); after silencing SIRT1,SRA01/04 cells senescence significantly increased (P<0.05); compared with the silence SIRT1 group,after silencing SIRT1 simultaneously adding ginsenoside Rb1,SIRT1 increased.Conclusion:Ginsenoside Rb1 can resist the senescence of lens epithelial cells by regulating the expression of SIRT1.
Keywords Age-related Cataract; Lens Epithelial Cells; Ginsenoside Rb1;SIRT1; Cell senescence; Apoptosis; Inflammation; Oxidative damage
中圖分类号:R284文献标识码:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.013
年龄相关性白内障(Age-related Cataract,ARC)是我国乃至全球范围内首位致盲性眼病[1]。随着社会的老龄化增加,ARC的患病率也随之增高,将成为社会的一大经济负担。尽管手术仍然是唯一有效的白内障治疗方法,但仍存在术后近远期的并发症[2]。因此研究ARC的病因和发病机制用于指导临床药物开发对其防治有着重要意义。ARC是复杂性多因素疾病,是环境和遗传因素共同作用下的结果。晶状体上皮细胞(Lens Epithelial Cells,LECs)是晶状体的代谢活跃中心,是ARC病理生理过程的关键细胞。目前普遍认为LECs的氧化损伤导致细胞衰老是ARC发生发展最重要的因素[3]。
沉默信息调节因子1(Silent Information Regulation 1,SIRT1)是一种参与调控细胞衰老的高度保守的生物酶,被称为“抗衰老酶”。SIRT1通过结合P53蛋白并使去乙酰化从而负性调节其活性减缓细胞衰老[4]。SIRT1还参与调节转录因子FOXO1的活性等细胞衰老相关信号通路[5]。
人参皂苷Rb1是人参中含量最多的成分,在调节机体免疫力、抗炎、抗氧化、抗衰老等方面发挥着重要作用。已有研究报告显示人参皂苷Rb1可通过SIRT1/核因子κB信号通路抑制高糖处理的H9C2细胞的凋亡与炎症反应[6],可以通过调控SIRT1/eNOS/NO信号通路抵抗人脐静脉内皮细胞衰老[7],还可以通过调控MAPK/PKA-LKB1细胞信号通路抑制紫外线诱导的细胞增殖[8]。本研究拟建立晶状体上皮细胞SRA01/04衰老模型,探讨人参皂苷Rb1是否能够延缓SRA01/04细胞衰老,并从调控SIRT1作用方面探讨人参皂苷Rb1对晶状体上皮抗衰老方面的影响。
1 材料与方法 1.1 材料
1.1.1 细胞 细胞采用人类晶状体上皮细胞株SRA01/04,购自中国科学院。
1.1.2 药物 人参皂苷Rb1购自普菲德(中国成都)。
1.1.3 试剂与仪器 人参皂苷Rb1(普菲德公司,成都,货号:41753-43-9);胎牛血清(GIBCO公司,澳洲,货号:10099-141);TRIzol试剂(Invitrogen公司,美国,货号:15596026);转染试剂盒(Invitrogen公司,美国,货号:11668-027);逆转录试剂盒(TaKaRa公司,日本,货号:RR036A);荧光定量试剂盒(Thermos fisher公司,美国,货号:4376598);兔抗SIRT1、GAPDH多克隆抗体(Abcam公司,美国,货号:ab189494,ab9485);SIRT1小干扰RNA(siSIRT1,锐博生物科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 将SRA01/04衰老模型分为对照组;20 μmol/L;40 μmol/L;60 μmol/L和80 μmol/L人参皂苷Rb1组。常规培养SRA01/04细胞传至2~3代后,按每孔5×105个细胞接种至24孔板中。加入50 μmol/L的过氧化氢(H2O2),继续培养后收取细胞。进行细胞形态、衰老相关β-半乳糖苷酶(Senescenceβ-Galactosidase)染色,当染色比较稳定时,即为本实验中SRA01/04细胞的衰老模型。
1.2.2 给药方法 将不同浓度的人参皂苷Rb1分别加入细胞培养液中,同等条件下培养48 h后观察细胞形态及β-半乳糖苷酶染色阳性率选择最宜浓度。
1.2.3 检测指标与方法
1)探讨人参皂苷Rb1抗SRA01/04细胞衰老的最佳浓度:
将不同浓度的人参皂苷Rb1分别加入细胞培养液中,同等条件下培养48 h后观察细胞形态及β-半乳糖苷酶染色阳性率选择最宜浓度。
2)探讨人参皂苷Rb1抗SRA01/04细胞衰老的机制:
在SRA01/04细胞生长至60%~70%时进行转染。分为对照组、siSIRT1组、人参皂苷Rb1组、siSIRT1+人参皂苷Rb1组。转染后加入80 μmol/L人参皂苷Rb1继续培养。各组在相同培养时间后,检测SIRT1的表达。RNA干扰序列是由锐博生物科技有限公司设计合成。
3)qRT-PCR法检测SIRT1表达量:
用TRIzol法提取各组细胞的RNA,测定RNA的纯度和浓度;按照TaKaRa试剂盒说明书逆转录为cDNA。选取SIRT1(assay ID:Hs01009006_m1),以人GAPDH(Hs02786624_g1)作為内参,加入TaqMan Expression Master Mix(Thermos fisher),用ABI公司的step-one型实时PCR仪分析,通过检测荧光信号,比较SIRT1和内参基因的Ct值,最后用2-△△Ct分析相关基因的表达情况。该实验对每个样本重复做3次。
4)免疫荧光:
在培养板中加入小圆片用于细胞爬片,经过4%的多聚甲醛固定,0.5%Triton X-100室温通,BSA室温封闭后,每张小圆片滴加50 μL一抗,放入湿盒4 ℃过夜。PBS清洗,擦干多余液体,滴加荧光二抗,放入湿盒室温孵育1 h,PBS浸洗,滴加Hochest进行染核,PBS清洗。封片后在荧光显微镜下采集图像。
1.3 统计学方法
采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析,计量资料采用均数±标准差(±s)表示,组间以单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SRA01/04细胞衰老模型的建立与验证
加入H2O2组衰老模型组的细胞形态由短胖变细长,并出现生长缓慢、贴壁细胞减少等衰老改变。见图1。
2.2 人参皂苷Rb1抗衰老的最佳浓度
在SRA01/04细胞衰老模型中加入不同浓度(20、40、60和80 μmol/L)的人参皂苷Rb1进行培养,48 h后观察β-半乳糖苷酶染色情况。结果显示,与对照组(0 μmol/L)比较,加入了人参皂苷Rb1的SRA01/04细胞,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),其中以60 μmol/L组效果最佳。见图2。
2.3 人参皂苷Rb1通过SIRT1抗SRA01/04细胞衰老
分为正常SRA01/04细胞组,SRA01/04衰老模型组,加入不同浓度(20、40、60和80 μmol/L)人参皂苷Rb1组。提取各组总RNA并检测SIRT1的表达。结果显示除了正常SRA01/04细胞中SIRT1最高外,与不加入人参皂苷Rb1组比较,加入了人参皂苷Rb1的衰老模型SRA01/04细胞SIRT1的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),以60 μmol/L人参皂苷Rb1组最明显。见图3。
2.4 免疫荧光验证人参皂苷Rb1通过SIRT1抗SRA01/04细胞衰老
检测SRA01/04衰老模型及同时加入60 μmol/L人参皂苷Rb1后SIRT1中的表达。与不加入人参皂苷Rb1组比较,加入人参皂苷Rb1组(60 μmol/L)SIRT1比SRA01/04衰老模型高。见图4。
2.5 沉默SIRT1以及同时加入人参皂苷Rb1对SIRT1表达的影响
SIRT1沉默后SIRT1水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);加入60 μmol/L人参皂苷Rb1后,SIRT1升高,但差异无统计学意义(P>0.05);同时SIRT1沉默及加入60 μmol/L人参皂苷Rb1组的SIRT1水平仅表现为轻度降低,较SIRT1沉默组明显提高。见图5。 3 讨论
ARC的病因和发病机制至今仍不清楚。目前手术仍是主要治疗手段,但手术远期效果不佳[9]。因此研究其病因和发病机制用于指导药物开发对ARC的防治有着重要意义。在众多ARC病因的假说中,LECs的DNA氧化损伤假说较为公认[3,10-11]。紫外线和过氧化氢(H2O2)等外源性刺激可以引起DNA损伤,同时,可诱导细胞衰老,导致年龄相关性疾病的发生[12-14]。目前关于衰老的学说有很多种,最常见的包括自由基、DNA损伤、端粒酶和炎症反应。SIRT1可通过参多种途径参与抗细胞衰老,包括调节代谢和炎症反应等[15-17]。本研究发现,60 μmol/L人参皂苷Rb1能明显上调SIRT1表达,延缓晶状体上皮细胞衰老。
在中国,人参历来被视为百草之王,其应用已有数千年。中医认为,人参具有大补元气,复脉固脱,补脾益肺,生津,安神等作用。有研究发现,人参药理作用主要包括调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老、抵抗疲劳等,临床应用广泛,同时也可用于强身固本[18]。而人参皂苷是从人参中提炼而来,被视为人参中最重要的活性成分,因其多方面的药理作用,成为了热门的研究对象。研究已发现人参皂苷在多种细胞中均具有延缓衰老作用[19-22]。本实验研究结果显示,SRA01/04细胞衰老模型中,SIRT1表达减少,人参皂苷Rb1干预后,SIRT1表达增加,而β-半乳糖苷酶染色阳性率降低;SIRT1沉默后发现,SIRT1表达明显减少;然而,在SIRT1沉默同时加用人参皂苷Rb1,SIRT1未发生明显减少。从正反两面说明,人参皂苷Rb1可以上调SIRT1表达,延缓SRA01/04细胞衰老。
本研究探讨了人参皂苷Rb1延缓SRA01/04细胞衰老的可能机制,结果表明人参皂苷Rb1可通过调控SIRT1延缓SRA01/04细胞衰老。但研究仍然停留在细胞层面,需要进一步在体内实验进行论证,最终用于临床防治ARC。
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(2019-05-19收稿 責任编辑:杨觉雄)