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摘要：以从实验室白酒酒醅中分离筛选并经诱变育种得到的高产酸性α-淀粉酶的菌株F21为试验对象，利用单因素及正交试验法进行液态产酶条件的优化，结果表明，菌株F21的最佳产酶培养基组成为麸皮20%、豆饼粉 15%、MgSO4·7H2O 005%、K2HPO4 01%，最佳培养条件：初始pH值为60、250 mL三角瓶中装液量为30 mL、接种量为8%、40 ℃ 200 rmin摇床培养48 h，此时酶活性达到2 3059 UmL，比优化前的初始酶活性（9873 UmL）提高 134 倍。
关键词：酸性α-淀粉酶；液态发酵；产酶条件；优化；正交试验
中图分类号： S188 3文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）21-0308-03
收稿日期：2017-05-05
基金项目：黑龙江省教育厅面上项目（编号：135109263）；黑龙江省齐齐哈尔市科学技术计划（编号：NYGG-201426）。
作者简介：郭宏文（1973—），男，河北深县人，硕士，副教授，主要从事微生物遗传研究。Tel：（0452）2742731；E-mail：ghw666@126com。
酸性α-淀粉酶是一种重要的工业酶制剂，能够在酸性条件下水解淀粉，保持高活性，被广泛应用于食品、发酵、纺织、制药和饲料等工业领域。近年来，随着我国国民经济的迅速发展，对酸性α-淀粉酶的需求也日益增加，研究并开发新型的酸性α-淀粉酶具有较高的社会经济效益。自1963年日本学者发现可以用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶1]以来，许多国家对其相继开展了相关研究，而我国学者从20世纪90年代始，在酸性α-淀粉酶工业菌种选育方面开展了相应的研究工作2-5]。齐齐哈尔大学食品与生物工程学院从北大仓酒厂白酒酒醅中分离筛选得到产酸性α-淀粉酶的菌株6]，并经诱变育种得到高产酶突变株F21。本研究以菌株F21为试验对象，利用单因素及正交试验法对其最佳产酶培养基组成及液态产酶条件进行优化，以进一步提高菌株的产酶能力。
1材料与方法
11试验材料
枯草芽孢杆菌F21，分离自白酒酒醅并经诱变处理得到。斜面保藏培养基：可溶性淀粉12%、蛋白胨08%、酵母粉02%、MgSO4·7H2O 005%、K2HPO4 01%、琼脂18%，pH值为70。产酶种子培养基：可溶性淀粉12%、蛋白胨 08%、酵母粉02%、MgSO4·7H2O 005%、K2HPO4 01%，pH值为70。产酶发酵培养基：可溶性淀粉15%、蛋白胨 10%、酵母粉05%、MgSO4·7H2O 005%、K2HPO4 01%，pH值为70。麸皮、玉米粉、豆饼粉为市售，试验用试剂均为分析纯。
12试验方法
菌种活化，接种到装有25 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，在摇床中36 ℃ 180 rmin培养18 h；取2 mL接到装有25 mL发酵培养基的三角瓶中，在摇床中36 ℃ 180 rmin培养48 h；4层纱布过滤，离心，参照Yoo等的改良法7-8]测定上清液酶活性。采用单因素法及正交试验法9]研究确定菌株最佳产酶发酵培养基的组成及发酵条件。
2结果与分析
21菌株最佳培养基单因素试验
211培养基中不同碳源对产酶的影响培养基分别添加可溶性淀粉、玉米淀粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖及麸皮为碳源，发酵后测定酶活性，制作产酶关系曲线。由图1可知，以蔗糖、麸皮为碳源，菌株F21的产酶能力相对较高，酶活性分别为1 2471、1 2084 UmL。考虑麸皮相对较为低廉，因此选择麸皮作为菌株F21发酵的碳源。
FK（W11]TPGHW1tif]
212培养基碳源含量对产酶的影响由图2可知，随麸皮含量的增加，酶活性呈先升高后降低趋势，麸皮含量为2%时的酶活性相对最高，为1 380 UmL。因此，2%为最佳碳源含量。
213培养基中不同氮源对产酶的影响以蛋白胨、酵母粉、豆饼粉、硫酸铵、尿素为单一氮源及以不同比例的蛋白胨 酵母粉、豆饼粉 酵母粉为复合氮源进行发酵，测定酶活
FK（W11]TPGHW2tif]
性。由图3可知，以15%豆饼粉为有机氮源时酶活性相对最高，为1 5026 UmL；配比为1%豆饼粉 05%酵母粉的复合有机氮源酶活性次之，为1 4378 UmL；15%尿素作单一无机氮源时酶活性相对最低。因此，15%豆饼粉为培养基最佳氮源。
214培养基氮源含量对产酶的影响由图4可知，随豆饼粉含量的增加，酶活性呈先升高后降低趋势，豆饼粉含量为 15%时的酶活性相对最高，为1 5146 UmL；随着豆饼粉含量的继续增加，酶活性开始降低。因此，15%为最佳氮源含量。
215培养基中添加金属离子对产酶的影响以没有镁离子的发酶培养基为基础培养基（对照），在基础培养基中加入一定量不同的金属离子，发酵测酶活性。由图5可知，添加Mg2 对产酶有较强的促进作用，酶活性较对照提高137%；添加Mn2 对产酶也有一定的促进作用，但酶活性提高极小；添加Cu2 、Fe2 、Zn2 、Ca2 对产酶有一定的抑制作用，Cu2 、Zn2 的抑制作用相對较强，而Fe2 、Ca2 对产酶的抑制作用相对较弱。因此，选择在培养基中添加Mg2 以提高菌种的产
酶能力。
22最适培养基正交试验
根据单因素试验结果，以麸皮、豆饼粉、Mg2 为试验因素，以酶活性为指标，采用L9（33）方案9]设计正交试验。由表1、表2可知，麸皮（碳源因素）对酶活性的影响相对最大，豆饼粉（氮源）次之，Mg2 影响相对最小，碳源因素对产酶的影响显著；最佳的三因素配比为A2B2C2，即培养基中添加20%麸皮、15%豆饼粉，Mg2 浓度为005%。 23产酶条件的优化
231培养基初始pH值对产酶的影响由图6可知，培养基pH值为60时的酶活性相对最高，为1 6958 UmL。因此，菌株F21发酵初始的pH为偏酸性为好，最适初始pH值为 60。
232培养温度对产酶的影响由图7可知，随培养温度的增加，酶活性呈先升高后降低趋势；培养温度为40 ℃时酶活性相对最高，为1 8890 UmL。因此，选择40 ℃为培养基最适培养温度。
233装液量对产酶的影响在250 mL三角瓶中分别装入15～50 mL的发酵培养基进行发酵，测定酶活性。由图8可知，装液量为30 mL时的酶活性相对最高，为2 0838 UmL。因此，三角瓶中的最适装液量为30 mL。
234接种量对产酶的影响由图9可知，接种量为8%时的酶活性相对最高，为2 1955 UmL，接种量超过8%酶活性下降。因此，选择8%为最佳接种量。
235轉速对产酶的影响由图10可知，转速为200 rmin时的酶活性相对最高，为2 3059 UmL。因此，选择摇床转速为200 rmin进行发酵。
3结论
对产酸性α-淀粉酶菌株F21进行液态发酵条件的优化，研究碳源、氮源、金属离子等培养基成分及培养基初始pH值、培养温度、装液量、接种量、转速等条件对产酶的影响，以确定菌株产酶的最佳培养基组成及培养条件。结果表明，使用价格比较低廉的20%麸皮为碳源、15%豆饼粉为氮源，同时添加005% MgSO4·7H2O、01% K2HPO4作为培养基，在培养条件为250 mL三角瓶中装液量为 30 mL、接种量为8%、培养基pH值为60、培养温度为40 ℃、摇床转速为 200 rmin 的情况下培养48 h，菌株F21产酸性α-淀粉酶的活性相对最高，此时酶活性为2 3059 UmL，比优化前初始酶活性（9873 UmL）提高134倍。
参考文献：
1]ZK（#]Minoda Y，Arai M，Torigoe Y Acid-stable α-amylase of black aspergilli：part Ⅱ Some general propertiesJ] Agr Biol Chem，1968，32（1）：104-109
2]钱萍 酸性淀粉酶菌株的诱变选育及酶学性质研究J] 食品工业科技，2012，33（11）：183-186
3]刘洋，王一琰，白黎婧，等 一株酸性淀粉酶产生菌的分离鉴定及其酶学性质研究J] 食品工业科技，2014，35（4）：174-178
4]王建玲，陈志鑫，刘逸寒，等 产耐酸性α-淀粉酶菌株的分离、鉴定、酶学特性研究及发酵培养基的优化J] 生物技术通报，2014（4）：159-163
5]张大为，张洁，王能强，等 一株产酸性 α-淀粉酶产生菌的分离鉴定及所产酶学特性的初步研究J] 现代食品科技，2015，31（2）：93-99
6]郭宏文，郭建华，邹东恢 酸性α-淀粉酶产生菌的筛选J] 江苏农业科学，2013，41（12）：360-361，362
7]Yoo Y J，Hong J，Hatch R T Comparison of alpha-amylase activities from different assay methodsJ] Biotechnology and Bioengineering，1987，30（1）：147-151
8]史永昶，姜涌明，樊飚，等 蛋白酶对解粉芽孢杆菌α-淀粉酶活力的影响J] 微生物学通报，1995（1）：23-25
9]李春喜，姜丽娜，邵云，等 生物统计学M] 北京：科学出版社，1997：330-332
关键词：酸性α-淀粉酶；液态发酵；产酶条件；优化；正交试验
中图分类号： S188 3文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）21-0308-03
收稿日期：2017-05-05
基金项目：黑龙江省教育厅面上项目（编号：135109263）；黑龙江省齐齐哈尔市科学技术计划（编号：NYGG-201426）。
作者简介：郭宏文（1973—），男，河北深县人，硕士，副教授，主要从事微生物遗传研究。Tel：（0452）2742731；E-mail：ghw666@126com。
酸性α-淀粉酶是一种重要的工业酶制剂，能够在酸性条件下水解淀粉，保持高活性，被广泛应用于食品、发酵、纺织、制药和饲料等工业领域。近年来，随着我国国民经济的迅速发展，对酸性α-淀粉酶的需求也日益增加，研究并开发新型的酸性α-淀粉酶具有较高的社会经济效益。自1963年日本学者发现可以用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶1]以来，许多国家对其相继开展了相关研究，而我国学者从20世纪90年代始，在酸性α-淀粉酶工业菌种选育方面开展了相应的研究工作2-5]。齐齐哈尔大学食品与生物工程学院从北大仓酒厂白酒酒醅中分离筛选得到产酸性α-淀粉酶的菌株6]，并经诱变育种得到高产酶突变株F21。本研究以菌株F21为试验对象，利用单因素及正交试验法对其最佳产酶培养基组成及液态产酶条件进行优化，以进一步提高菌株的产酶能力。
1材料与方法
11试验材料
枯草芽孢杆菌F21，分离自白酒酒醅并经诱变处理得到。斜面保藏培养基：可溶性淀粉12%、蛋白胨08%、酵母粉02%、MgSO4·7H2O 005%、K2HPO4 01%、琼脂18%，pH值为70。产酶种子培养基：可溶性淀粉12%、蛋白胨 08%、酵母粉02%、MgSO4·7H2O 005%、K2HPO4 01%，pH值为70。产酶发酵培养基：可溶性淀粉15%、蛋白胨 10%、酵母粉05%、MgSO4·7H2O 005%、K2HPO4 01%，pH值为70。麸皮、玉米粉、豆饼粉为市售，试验用试剂均为分析纯。
12试验方法
菌种活化，接种到装有25 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，在摇床中36 ℃ 180 rmin培养18 h；取2 mL接到装有25 mL发酵培养基的三角瓶中，在摇床中36 ℃ 180 rmin培养48 h；4层纱布过滤，离心，参照Yoo等的改良法7-8]测定上清液酶活性。采用单因素法及正交试验法9]研究确定菌株最佳产酶发酵培养基的组成及发酵条件。
2结果与分析
21菌株最佳培养基单因素试验
211培养基中不同碳源对产酶的影响培养基分别添加可溶性淀粉、玉米淀粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖及麸皮为碳源，发酵后测定酶活性，制作产酶关系曲线。由图1可知，以蔗糖、麸皮为碳源，菌株F21的产酶能力相对较高，酶活性分别为1 2471、1 2084 UmL。考虑麸皮相对较为低廉，因此选择麸皮作为菌株F21发酵的碳源。
FK（W11]TPGHW1tif]
212培养基碳源含量对产酶的影响由图2可知，随麸皮含量的增加，酶活性呈先升高后降低趋势，麸皮含量为2%时的酶活性相对最高，为1 380 UmL。因此，2%为最佳碳源含量。
213培养基中不同氮源对产酶的影响以蛋白胨、酵母粉、豆饼粉、硫酸铵、尿素为单一氮源及以不同比例的蛋白胨 酵母粉、豆饼粉 酵母粉为复合氮源进行发酵，测定酶活
FK（W11]TPGHW2tif]
性。由图3可知，以15%豆饼粉为有机氮源时酶活性相对最高，为1 5026 UmL；配比为1%豆饼粉 05%酵母粉的复合有机氮源酶活性次之，为1 4378 UmL；15%尿素作单一无机氮源时酶活性相对最低。因此，15%豆饼粉为培养基最佳氮源。
214培养基氮源含量对产酶的影响由图4可知，随豆饼粉含量的增加，酶活性呈先升高后降低趋势，豆饼粉含量为 15%时的酶活性相对最高，为1 5146 UmL；随着豆饼粉含量的继续增加，酶活性开始降低。因此，15%为最佳氮源含量。
215培养基中添加金属离子对产酶的影响以没有镁离子的发酶培养基为基础培养基（对照），在基础培养基中加入一定量不同的金属离子，发酵测酶活性。由图5可知，添加Mg2 对产酶有较强的促进作用，酶活性较对照提高137%；添加Mn2 对产酶也有一定的促进作用，但酶活性提高极小；添加Cu2 、Fe2 、Zn2 、Ca2 对产酶有一定的抑制作用，Cu2 、Zn2 的抑制作用相對较强，而Fe2 、Ca2 对产酶的抑制作用相对较弱。因此，选择在培养基中添加Mg2 以提高菌种的产
酶能力。
22最适培养基正交试验
根据单因素试验结果，以麸皮、豆饼粉、Mg2 为试验因素，以酶活性为指标，采用L9（33）方案9]设计正交试验。由表1、表2可知，麸皮（碳源因素）对酶活性的影响相对最大，豆饼粉（氮源）次之，Mg2 影响相对最小，碳源因素对产酶的影响显著；最佳的三因素配比为A2B2C2，即培养基中添加20%麸皮、15%豆饼粉，Mg2 浓度为005%。 23产酶条件的优化
231培养基初始pH值对产酶的影响由图6可知，培养基pH值为60时的酶活性相对最高，为1 6958 UmL。因此，菌株F21发酵初始的pH为偏酸性为好，最适初始pH值为 60。
232培养温度对产酶的影响由图7可知，随培养温度的增加，酶活性呈先升高后降低趋势；培养温度为40 ℃时酶活性相对最高，为1 8890 UmL。因此，选择40 ℃为培养基最适培养温度。
233装液量对产酶的影响在250 mL三角瓶中分别装入15～50 mL的发酵培养基进行发酵，测定酶活性。由图8可知，装液量为30 mL时的酶活性相对最高，为2 0838 UmL。因此，三角瓶中的最适装液量为30 mL。
234接种量对产酶的影响由图9可知，接种量为8%时的酶活性相对最高，为2 1955 UmL，接种量超过8%酶活性下降。因此，选择8%为最佳接种量。
235轉速对产酶的影响由图10可知，转速为200 rmin时的酶活性相对最高，为2 3059 UmL。因此，选择摇床转速为200 rmin进行发酵。
3结论
对产酸性α-淀粉酶菌株F21进行液态发酵条件的优化，研究碳源、氮源、金属离子等培养基成分及培养基初始pH值、培养温度、装液量、接种量、转速等条件对产酶的影响，以确定菌株产酶的最佳培养基组成及培养条件。结果表明，使用价格比较低廉的20%麸皮为碳源、15%豆饼粉为氮源，同时添加005% MgSO4·7H2O、01% K2HPO4作为培养基，在培养条件为250 mL三角瓶中装液量为 30 mL、接种量为8%、培养基pH值为60、培养温度为40 ℃、摇床转速为 200 rmin 的情况下培养48 h，菌株F21产酸性α-淀粉酶的活性相对最高，此时酶活性为2 3059 UmL，比优化前初始酶活性（9873 UmL）提高134倍。
参考文献：
1]ZK（#]Minoda Y，Arai M，Torigoe Y Acid-stable α-amylase of black aspergilli：part Ⅱ Some general propertiesJ] Agr Biol Chem，1968，32（1）：104-109
2]钱萍 酸性淀粉酶菌株的诱变选育及酶学性质研究J] 食品工业科技，2012，33（11）：183-186
3]刘洋，王一琰，白黎婧，等 一株酸性淀粉酶产生菌的分离鉴定及其酶学性质研究J] 食品工业科技，2014，35（4）：174-178
4]王建玲，陈志鑫，刘逸寒，等 产耐酸性α-淀粉酶菌株的分离、鉴定、酶学特性研究及发酵培养基的优化J] 生物技术通报，2014（4）：159-163
5]张大为，张洁，王能强，等 一株产酸性 α-淀粉酶产生菌的分离鉴定及所产酶学特性的初步研究J] 现代食品科技，2015，31（2）：93-99
6]郭宏文，郭建华，邹东恢 酸性α-淀粉酶产生菌的筛选J] 江苏农业科学，2013，41（12）：360-361，362
7]Yoo Y J，Hong J，Hatch R T Comparison of alpha-amylase activities from different assay methodsJ] Biotechnology and Bioengineering，1987，30（1）：147-151
8]史永昶，姜涌明，樊飚，等 蛋白酶对解粉芽孢杆菌α-淀粉酶活力的影响J] 微生物学通报，1995（1）：23-25
9]李春喜，姜丽娜，邵云，等 生物统计学M] 北京：科学出版社，1997：330-332