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【摘 要】 目的：以栎瘿酸为例，研究藏药有效成分与功能蛋白的相互作用与识别过程。方法：利用荧光发射光谱、同步荧光、紫外光谱等方法进行研究。结果：结果显示栎瘿酸引起了牛血清白蛋白BSA荧光静态猝灭;获得不同温度下二者的结合常数、结合位点数及结合过程中热力学参数;得知二者结合是以氢键和范德华力为主要作用力的自发、放热过程;二者之间发生非辐射能量转移，结合部位位于BSA分子Site Ⅱ位点，平均结合距离为4.134 nm;在识别过程中，BSA结构及色氨酸所处微环境疏水性增加，色胺酸残基流动性增强。结论：通过本方法可建立一套用于表征藏药中有效成分与功能蛋白之间相互作用与识别过程的实验方法。
【关键词】 藏药;有效成分;功能蛋白;秦艽;栎瘿酸
【中图分类号】R917 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）12-0054-07
Abstract：Objective Taking Roburic acid as an example，the interaction and recognition process between effective constituents of Tibetan medicine and functional proteins were studied in this paper. Methods Fluorescence emission spectroscopy，synchronous fluorescence，ultraviolet spectroscopy and other methods were used in this study. Result The result showed that，firstly，the binding procedures between Roburic acid and BSA were static quenching process caused by the formation of non-fluorescigenic complex; secondly，both binding constants and binding site numbers of Roburic acid and BSA at different temperatures were determined; thirdly，ΔG，ΔH and ΔS during the binding process can be obtained and all of these parameters were negative，which indicated the binding procedure between Roburic acid and BSA was spontaneous，exothermic reaction taking hydrogen bond and van der waals force as main force; fourthly，“Forster non-radiative energy transfer” was taken place between Roburic acid and BSA，and Roburic acid bound to the Site Ⅱ of BSA while the binding distances was 4.134nm; fifthly，during the recognition procedure，with the increasing concentration of Roburic acid，the hydrophobicity of both BSA structure and the microenvironment of tryptophan in BSA increased，and the tryptophan residues were no longer restricted.Conclusion This study can be used to establish a set of experimental methods to characterize the interaction and recognition process between traditional Tibetan medicine effective constituents and functional protein.
Keywords：Tibetan Medicine; Effective Constituent; Functional Protein; Gentianae macrophyllae Radix; Roburic Acid
在生物學中，分子间相互作用与识别是形成高度专一性识别、反应及调控等过程的基础，诸如底物与受体的结合识别、酶反应及抗体-抗原的结合识别等。而在药学，尤其是民族药的开发研究领域，分子间相互作用也是一个重要的研究内容，它在基于传统药物的新药筛选开发、药物药效学及药动学研究中均得到广泛应用。藏药在我国有着悠久的应用历史、深厚的民众基础及丰富的藏民族文化内涵。近年来，藏药以其独特的功效受到越来越多研究者的关注，对其的现代化研究与应用也日益得到重视。而关于藏药当中有效成分与离子通道、膜蛋白等药物受体、功能蛋白的相互作用与识别研究还未见报道。
秦艽为龙胆科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.，麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.，粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.或小秦艽Gentiana dahurica Fisch.的干燥根[1]，属于常用藏药[2-4]，藏文名为吉解嘎保、吉解那保等[5]。该药物为藏族人民的繁衍生息做出了重要的贡献，如《四部医典》中记载：“吉解嘎保可治六腑热和胆热”;《如意宝树》中记载：“吉解嘎保可止血，炮制后外敷消肿、愈伤。吉解那保可消炎，治四肢关节红肿，喉蛾，咽喉嘶哑”;《晶珠本草》中记载：“吉解那可用于消肿、喉蛾、干黄水”等[5]。栎瘿酸为一种五环三萜类化合物，是2015版《中国药典》中规定秦艽药材的药材鉴别成分[1]，其药理临床作用如抗炎也常见报道[6]。 本研究以藏药秦艽为代表，选用秦艽中有效成分栎瘿酸，利用光谱学方法研究了栎瘿酸与以运载蛋白牛血清白蛋白（BSA）为代表的功能蛋白之间的相互作用与识别过程，旨在进一步理解传统藏药有效成分的作用机制。并以此为例，建立一套可用于表征其它藏药有效成分与功能蛋白如受体、离子通道等之间相互作用与识别的实验方法，进而为传统藏药作用机制的现代化分析研究，以及基于传统藏药的药物开发提供实验依据及理论支撑。
1 仪器与试剂
1.1 仪器 PerkinElmer LS55荧光光谱仪及PTP-1 Peltier system控温控件，Perkin Elmer Lambda 25紫外-可见分光光度仪器光度计，Millipore Milli-Q超纯水系统。
1.2 主要试剂 栎瘿酸（中国食品药品检定研究院，98%），用二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，≥99.9%）配置成浓度为4.0×10-2 mol/L的储备溶液。BSA（Amresco，>98%）用0.01mol/L的PBS配置成1×10-6 mol/L的储备溶液。华法林（中国食品药品检定研究院，98%），布洛芬（大连美仑生物技术有限公司，>98%），实验用水为二次去离子水。
2 实验方法
2.1 荧光猝灭实验 移取1×10-6 mol/L的BSA溶液 2 mL置于石英比色皿中并分别于288K、298K和308K实验温度下测定样品的荧光发射光谱。测定完成后，用微量注射器分别向其中注入不同体积的4.0×10-2 mol/L的櫟瘿酸储备液进行混合，使得栎瘿酸终浓度分别为5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，混合完成后分别于相应温度下反应至稳定后再次测定其荧光发射光谱。相关仪器参数如下：激发波长278 nm，激发狭缝和发射狭缝宽度均为3 nm，扫描速度1200 nm/min，扫描范围300～400 nm。
2.2 结合位点竞争实验 移取1×10-6 mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中，分别注入华法林/布洛芬储备液，使对应药品终浓度均分别为1×10-6 mol/L，在298 K温度下进行相互作用30 min。反应完成后，用微量进样器分别向其中加入不同体积的栎瘿酸储备液，使得栎瘿酸终浓度分别为5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，混合完成至反应稳定后再次测定其荧光发射光谱。相关仪器参数如2.1。
2.3 同步荧光 于298K下移取1×10-6 mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中，测定样品同步荧光光谱。测定完成后，用微量注射器分别向其中加入不同体积的栎瘿酸储备液进行混合，使得栎瘿酸终浓度分别为5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，反应稳定后于298 K温度下分别测定其同步荧光光谱。相关仪器参数如下：当测定Δλ=60 nm的同步荧光光谱时，激发狭缝和发射狭缝宽度均为3 nm。当测定Δλ=15 nm的同步荧光光谱时，激发狭缝和发射狭缝宽度均为8 nm。扫描速度均为1200 nm/min，扫描范围220～320 nm。
2.4 Rees红边激发荧光位移的测定 分别在激发波长为266、272、278、284、290和296 nm下，测定1×10-6 mol/L的BSA溶液在298 K温度下的荧光发射光谱，之后在BSA溶液中分别加入不同体积的栎瘿酸储备液，使得栎瘿酸终浓度分别为0×10-6、5×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6 mol/L，并测定其在不同激发波长下对应荧光发射光谱。相关仪器参数如下：激发狭缝和发射狭缝宽度均为3 nm，扫描速度1200 nm/min，扫描范围300～400 nm。
3 结果与讨论
3.1 BSA与栎瘿酸结合过程的荧光发射光谱分析 图1所示为BSA与栎瘿酸在298 K温度下作用过程的荧光发射光谱，可以看出，伴随着栎瘿酸浓度的上升，样品体系发生了荧光猝灭现象，荧光强度由754.3下降至487.9，同时最大荧光发射峰位从341 nm轻微的蓝移至335.5 nm。这一现象表明BSA与栎瘿酸之间发生了相互作用，荧光发射峰位轻微蓝移表明蛋白结构发生了细微的改变，蛋白结构的疏水性有了轻微的增加[7]。
3.7 BSA与栎瘿酸识别过程的构象变化-同步荧光光谱光谱分析
图5展示了BSA在与栎瘿酸结合过程中当Δλ=60nm和Δλ=15nm的同步荧光光谱。从图中可以看出，伴随着加入的栎瘿酸浓度的增加，BSA在Δλ=60nm和Δλ=15nm时的同步荧光强度均发生了明显改变，说明BSA分子中的酪氨酸、色氨酸残基均参与了荧光猝灭过程，其中对色氨酸的猝灭效果更为明显。同时我们注意到，伴随着栎瘿酸浓度的增加，Δλ=15 nm时的同步荧光光谱的最大发射峰位并未发生明显的改变，而当Δλ=60 nm的同步荧光光谱则显示出轻微蓝移现象，说明在BSA与栎瘿酸的结合过程中，蛋白中酪氨酸残基所处的微环境微环境没有明显的改变，而色氨酸残基所处的微环境微环境疏水性略微增强。
3.8 BSA与栎瘿酸识别过程的构象变化—红边激发位移（REES）分析 红边激发位移是指当溶剂介质存在缓慢舒张作用时，色氨酸中吲哚环与临近偶极子的电子结合作用即可引起色氨酸电子跃迁能分配的一种现象，是一种监测荧光发色基团微环境改变的方法。当蛋白质受到激发光照射时，若蛋白质中色氨酸残基所处微环境是流动的，则其在发射荧光之前就已经出现了缓慢舒张作用，此时色氨酸残基产生的荧光光谱的发射波长不发生变化。如果色氨酸残基处在受限环境当中，色氨酸中处于激发态的吲哚环将会产生缓慢舒张作用，并且激发波长不同，其发射波长也不同[18-19]。 在实验中可以发现，在266 nm的激发波长下，BSA荧光发射光谱的最大发射波长位于346 nm，所以选取326（FL）和366（FR）这两个等波长点进行双波长处理。由图6可见，在相同激发波长下，BSA的FL/FR值伴随着栎瘿酸浓度的增大而上升，说明伴随着BSA与栎瘿酸反应的进行，荧光发射光谱发生蓝移[18]，这也从另一方面验证“3.1”中得到的结果，即说明BSA结构的疏水性伴随着反应的进行而有所增加。
当栎瘿酸浓度分别为0×10-6、5×10-6、15×10-6 mol/L时，随着激发波长的逐渐增大，BSA的FL/FR值缓慢降低，产生了Rees现象，说明在上述情况下，BSA中色氨酸残基的运动受到限制。然而，随着体系中栎瘿酸浓度的扩大，当栎瘿酸浓度分别为20×10-6、25×10-6mol/L时，BSA的FL/FR值不再随着激发波长的增大而明显降低，即不再产生Rees现象，说明伴随着栎瘿酸浓度的升高，由于BSA构象的改变，分子中色氨酸残基处于了相对流动的微环境当中。
4 结论
本研究设计一种全面表征传统藏药中有效成分与功能蛋白相互作用与识别过程的实验方法。本研究以藏药秦艽中有效成分栎瘿酸以及运载蛋白为例，在不同温度下利用本方法进行了实验，结果显示：栎瘿酸与BSA二者之间发生的结合作用引起了BSA内源荧光猝灭，造成的猝灭现象为形成了不发荧光络合物的静态猝灭过程。通过测量可获得二者在不同温度下结合常数、结合位点数以及结合过程中相关热力学参数，并得知二者相互结合是以氢键和范德华力为主要作用力的自发、放热反应过程。同时，二者结合过程中发生了非辐射能量转移，且栎瘿酸结合于BSA分子中的Site Ⅱ位点，平均结合距离为4.134 nm。另外，在二者識别过程中，BSA结构的疏水性有轻微的增加，而且伴随着栎瘿酸浓度的增加，BSA中色氨酸所处微环境疏水性有了轻微增加，微环境流动性逐步增强。
参考文献
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[3] 张景瑜，门连超，吴晓军，等. 抗高原缺氧藏药的研究进展 [J]. 中国民族民间医药，2017，26 （22）： 42-45.
[4] 赵勤，王乐乐，魏立鹏，等. 麻花秦艽醇提物对佐剂性关节炎大鼠的影响 [J]. 中药药理与临床，2015，31 （1）：145-147.
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（收稿日期：2021-02-26 編辑：程鹏飞）
【关键词】 藏药;有效成分;功能蛋白;秦艽;栎瘿酸
【中图分类号】R917 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）12-0054-07
Abstract：Objective Taking Roburic acid as an example，the interaction and recognition process between effective constituents of Tibetan medicine and functional proteins were studied in this paper. Methods Fluorescence emission spectroscopy，synchronous fluorescence，ultraviolet spectroscopy and other methods were used in this study. Result The result showed that，firstly，the binding procedures between Roburic acid and BSA were static quenching process caused by the formation of non-fluorescigenic complex; secondly，both binding constants and binding site numbers of Roburic acid and BSA at different temperatures were determined; thirdly，ΔG，ΔH and ΔS during the binding process can be obtained and all of these parameters were negative，which indicated the binding procedure between Roburic acid and BSA was spontaneous，exothermic reaction taking hydrogen bond and van der waals force as main force; fourthly，“Forster non-radiative energy transfer” was taken place between Roburic acid and BSA，and Roburic acid bound to the Site Ⅱ of BSA while the binding distances was 4.134nm; fifthly，during the recognition procedure，with the increasing concentration of Roburic acid，the hydrophobicity of both BSA structure and the microenvironment of tryptophan in BSA increased，and the tryptophan residues were no longer restricted.Conclusion This study can be used to establish a set of experimental methods to characterize the interaction and recognition process between traditional Tibetan medicine effective constituents and functional protein.
Keywords：Tibetan Medicine; Effective Constituent; Functional Protein; Gentianae macrophyllae Radix; Roburic Acid
在生物學中，分子间相互作用与识别是形成高度专一性识别、反应及调控等过程的基础，诸如底物与受体的结合识别、酶反应及抗体-抗原的结合识别等。而在药学，尤其是民族药的开发研究领域，分子间相互作用也是一个重要的研究内容，它在基于传统药物的新药筛选开发、药物药效学及药动学研究中均得到广泛应用。藏药在我国有着悠久的应用历史、深厚的民众基础及丰富的藏民族文化内涵。近年来，藏药以其独特的功效受到越来越多研究者的关注，对其的现代化研究与应用也日益得到重视。而关于藏药当中有效成分与离子通道、膜蛋白等药物受体、功能蛋白的相互作用与识别研究还未见报道。
秦艽为龙胆科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.，麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.，粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.或小秦艽Gentiana dahurica Fisch.的干燥根[1]，属于常用藏药[2-4]，藏文名为吉解嘎保、吉解那保等[5]。该药物为藏族人民的繁衍生息做出了重要的贡献，如《四部医典》中记载：“吉解嘎保可治六腑热和胆热”;《如意宝树》中记载：“吉解嘎保可止血，炮制后外敷消肿、愈伤。吉解那保可消炎，治四肢关节红肿，喉蛾，咽喉嘶哑”;《晶珠本草》中记载：“吉解那可用于消肿、喉蛾、干黄水”等[5]。栎瘿酸为一种五环三萜类化合物，是2015版《中国药典》中规定秦艽药材的药材鉴别成分[1]，其药理临床作用如抗炎也常见报道[6]。 本研究以藏药秦艽为代表，选用秦艽中有效成分栎瘿酸，利用光谱学方法研究了栎瘿酸与以运载蛋白牛血清白蛋白（BSA）为代表的功能蛋白之间的相互作用与识别过程，旨在进一步理解传统藏药有效成分的作用机制。并以此为例，建立一套可用于表征其它藏药有效成分与功能蛋白如受体、离子通道等之间相互作用与识别的实验方法，进而为传统藏药作用机制的现代化分析研究，以及基于传统藏药的药物开发提供实验依据及理论支撑。
1 仪器与试剂
1.1 仪器 PerkinElmer LS55荧光光谱仪及PTP-1 Peltier system控温控件，Perkin Elmer Lambda 25紫外-可见分光光度仪器光度计，Millipore Milli-Q超纯水系统。
1.2 主要试剂 栎瘿酸（中国食品药品检定研究院，98%），用二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，≥99.9%）配置成浓度为4.0×10-2 mol/L的储备溶液。BSA（Amresco，>98%）用0.01mol/L的PBS配置成1×10-6 mol/L的储备溶液。华法林（中国食品药品检定研究院，98%），布洛芬（大连美仑生物技术有限公司，>98%），实验用水为二次去离子水。
2 实验方法
2.1 荧光猝灭实验 移取1×10-6 mol/L的BSA溶液 2 mL置于石英比色皿中并分别于288K、298K和308K实验温度下测定样品的荧光发射光谱。测定完成后，用微量注射器分别向其中注入不同体积的4.0×10-2 mol/L的櫟瘿酸储备液进行混合，使得栎瘿酸终浓度分别为5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，混合完成后分别于相应温度下反应至稳定后再次测定其荧光发射光谱。相关仪器参数如下：激发波长278 nm，激发狭缝和发射狭缝宽度均为3 nm，扫描速度1200 nm/min，扫描范围300～400 nm。
2.2 结合位点竞争实验 移取1×10-6 mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中，分别注入华法林/布洛芬储备液，使对应药品终浓度均分别为1×10-6 mol/L，在298 K温度下进行相互作用30 min。反应完成后，用微量进样器分别向其中加入不同体积的栎瘿酸储备液，使得栎瘿酸终浓度分别为5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，混合完成至反应稳定后再次测定其荧光发射光谱。相关仪器参数如2.1。
2.3 同步荧光 于298K下移取1×10-6 mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中，测定样品同步荧光光谱。测定完成后，用微量注射器分别向其中加入不同体积的栎瘿酸储备液进行混合，使得栎瘿酸终浓度分别为5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，反应稳定后于298 K温度下分别测定其同步荧光光谱。相关仪器参数如下：当测定Δλ=60 nm的同步荧光光谱时，激发狭缝和发射狭缝宽度均为3 nm。当测定Δλ=15 nm的同步荧光光谱时，激发狭缝和发射狭缝宽度均为8 nm。扫描速度均为1200 nm/min，扫描范围220～320 nm。
2.4 Rees红边激发荧光位移的测定 分别在激发波长为266、272、278、284、290和296 nm下，测定1×10-6 mol/L的BSA溶液在298 K温度下的荧光发射光谱，之后在BSA溶液中分别加入不同体积的栎瘿酸储备液，使得栎瘿酸终浓度分别为0×10-6、5×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6 mol/L，并测定其在不同激发波长下对应荧光发射光谱。相关仪器参数如下：激发狭缝和发射狭缝宽度均为3 nm，扫描速度1200 nm/min，扫描范围300～400 nm。
3 结果与讨论
3.1 BSA与栎瘿酸结合过程的荧光发射光谱分析 图1所示为BSA与栎瘿酸在298 K温度下作用过程的荧光发射光谱，可以看出，伴随着栎瘿酸浓度的上升，样品体系发生了荧光猝灭现象，荧光强度由754.3下降至487.9，同时最大荧光发射峰位从341 nm轻微的蓝移至335.5 nm。这一现象表明BSA与栎瘿酸之间发生了相互作用，荧光发射峰位轻微蓝移表明蛋白结构发生了细微的改变，蛋白结构的疏水性有了轻微的增加[7]。
3.7 BSA与栎瘿酸识别过程的构象变化-同步荧光光谱光谱分析
图5展示了BSA在与栎瘿酸结合过程中当Δλ=60nm和Δλ=15nm的同步荧光光谱。从图中可以看出，伴随着加入的栎瘿酸浓度的增加，BSA在Δλ=60nm和Δλ=15nm时的同步荧光强度均发生了明显改变，说明BSA分子中的酪氨酸、色氨酸残基均参与了荧光猝灭过程，其中对色氨酸的猝灭效果更为明显。同时我们注意到，伴随着栎瘿酸浓度的增加，Δλ=15 nm时的同步荧光光谱的最大发射峰位并未发生明显的改变，而当Δλ=60 nm的同步荧光光谱则显示出轻微蓝移现象，说明在BSA与栎瘿酸的结合过程中，蛋白中酪氨酸残基所处的微环境微环境没有明显的改变，而色氨酸残基所处的微环境微环境疏水性略微增强。
3.8 BSA与栎瘿酸识别过程的构象变化—红边激发位移（REES）分析 红边激发位移是指当溶剂介质存在缓慢舒张作用时，色氨酸中吲哚环与临近偶极子的电子结合作用即可引起色氨酸电子跃迁能分配的一种现象，是一种监测荧光发色基团微环境改变的方法。当蛋白质受到激发光照射时，若蛋白质中色氨酸残基所处微环境是流动的，则其在发射荧光之前就已经出现了缓慢舒张作用，此时色氨酸残基产生的荧光光谱的发射波长不发生变化。如果色氨酸残基处在受限环境当中，色氨酸中处于激发态的吲哚环将会产生缓慢舒张作用，并且激发波长不同，其发射波长也不同[18-19]。 在实验中可以发现，在266 nm的激发波长下，BSA荧光发射光谱的最大发射波长位于346 nm，所以选取326（FL）和366（FR）这两个等波长点进行双波长处理。由图6可见，在相同激发波长下，BSA的FL/FR值伴随着栎瘿酸浓度的增大而上升，说明伴随着BSA与栎瘿酸反应的进行，荧光发射光谱发生蓝移[18]，这也从另一方面验证“3.1”中得到的结果，即说明BSA结构的疏水性伴随着反应的进行而有所增加。
当栎瘿酸浓度分别为0×10-6、5×10-6、15×10-6 mol/L时，随着激发波长的逐渐增大，BSA的FL/FR值缓慢降低，产生了Rees现象，说明在上述情况下，BSA中色氨酸残基的运动受到限制。然而，随着体系中栎瘿酸浓度的扩大，当栎瘿酸浓度分别为20×10-6、25×10-6mol/L时，BSA的FL/FR值不再随着激发波长的增大而明显降低，即不再产生Rees现象，说明伴随着栎瘿酸浓度的升高，由于BSA构象的改变，分子中色氨酸残基处于了相对流动的微环境当中。
4 结论
本研究设计一种全面表征传统藏药中有效成分与功能蛋白相互作用与识别过程的实验方法。本研究以藏药秦艽中有效成分栎瘿酸以及运载蛋白为例，在不同温度下利用本方法进行了实验，结果显示：栎瘿酸与BSA二者之间发生的结合作用引起了BSA内源荧光猝灭，造成的猝灭现象为形成了不发荧光络合物的静态猝灭过程。通过测量可获得二者在不同温度下结合常数、结合位点数以及结合过程中相关热力学参数，并得知二者相互结合是以氢键和范德华力为主要作用力的自发、放热反应过程。同时，二者结合过程中发生了非辐射能量转移，且栎瘿酸结合于BSA分子中的Site Ⅱ位点，平均结合距离为4.134 nm。另外，在二者識别过程中，BSA结构的疏水性有轻微的增加，而且伴随着栎瘿酸浓度的增加，BSA中色氨酸所处微环境疏水性有了轻微增加，微环境流动性逐步增强。
参考文献
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（收稿日期：2021-02-26 編辑：程鹏飞）