【摘 要】
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目的:构建人细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cyclin2dependent kinase inhibitor)P21WAF基因的真核表达载体pEGFP-P21,建立稳定表达P21蛋白与pEGFP融合蛋白的AGS细胞系,,为
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科
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目的:构建人细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cyclin2dependent kinase inhibitor)P21WAF基因的真核表达载体pEGFP-P21,建立稳定表达P21蛋白与pEGFP融合蛋白的AGS细胞系,,为进一步研究P21对下游基因的调节作用提供实验基础.方法:用PCR法在pCDNA3-P21质粒中定向插入EcoR1、BamH1酶切位点,扩增P21 cDNA;采用亚克隆技术构建绿色荧光蛋白pEGFP-C2-P21融合基因表达载体;PCR法、双酶切及测序鉴定.脂质体转染试剂将重组载体转染人胃癌AGS细胞系,G418筛选20天挑取表达pEGFP-P21的抗性克隆扩大培养、传代.荧光显微镜直接观察pEGFP-p21在细胞中的分布和定位,流式细胞术分析细胞周期.结果:鉴定结果表明重构载体pEGFP-P21序列和方向正确,借助绿色荧光蛋白直观观察P21定位于AGS细胞核.细胞周期分析细胞阻滞与G1/S期.结论:成功建立稳定表达pEGFP-P21的AGS细胞株,P21在细胞核内发挥周期阻滞的作用,P21对细胞周期的影响可能为其调节其他因子是始动因素,为进一步研究P21基因的功能奠定了实验基础.
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