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摘要：目的：探讨力竭游泳运动对小鼠空间学习记忆的影响，以及小鼠前脑皮层和海马胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的作用。方法；建立反复力竭游泳运动小鼠模型，通过Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力的变化，采用免疫组化检测力竭游泳运动后即刻（0h）、12 h、24 h和1w小鼠前脑皮层、海马胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的表达。结果：与对照组小鼠比较，反复力竭游泳组小鼠在力竭游泳后12 h和24 h小鼠的逃避潜伏期（训练周期1）显著增加，第一象限停留时间明显减少，小鼠空间学习记忆能力显著降低（P0.05）。结论；力竭游泳运动导致了小鼠空间学习记忆功能减退，同时引起了海马和前脑皮层GDNF的表达出现不同程度的升高；GDNF参与了中枢疲劳产生与恢复的生物学调控过程。
关键词：力竭运动；空间记忆；GDNF；海马；前脑皮层
中图分类号：G804.5 文献标识码：A 文章编号：1009—9840（2016）04—0055—04
近年来，运动性疲劳一直是竞技体育领域的研究热点，尤其是对运动中枢疲劳的研究。长期大运动量训练后，中枢疲劳一旦发生，将会引起机体发生一系列改变，如动作控制能力下降，学习记忆能力减弱，运动认知出现偏差等，继而引起运动成绩下降。出现这些现象的主要原因可能是，过度运动应激导致了前脑皮层和海马的损伤。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）在神经元细胞的生长与死亡调控过程中发挥了不可替代的作用，其生物学效应倍受关注。研究表明，GDNF在神经细胞及神经相关细胞中有广泛表达。当大鼠受到外伤性脑损伤后，对受损海马部位的GDNF进行检测，发现GDNF表达增强。本研究通过检测力竭游泳运动后不同时间小鼠前脑皮层、海马GDNF的表达，探讨过度运动应激引起中枢疲劳产生及恢复的可能机制，为运动训练调控提供理论依据。
1研究对象与方法
1.1研究对象
3月龄小鼠20只（健康昆明品系，雌雄各半），体重22～26克，山东大学生命科学学院细胞生物学实验室提供。国家标准啮齿类动物饲料，自由饮食，分笼饲养，每笼5只。温度24℃～26℃，相对湿度40%～60%。
将动物适应性喂养一周后，按体重随机分为2组，对照组10只，运动组10只。
1.2建立力竭运动模型
适应性训练：30±2℃水温，适应性自由泳训练3d，第一天15min，第二天30 min，第三天45min。
反复性力竭游泳运动训练：连续4周，每周游泳训练5天，每天1次，均游泳至力竭；为避免小鼠产生适应现象，在训练的后期增加训练强度（加2%体重的负重物）。训练结束后，捞起吹干，放回笼中休息。
力竭的判断标准为：1）动作失调，无法坚持继续游泳；2）沉入水底，超过3 s不能回到水面。
1.3检测学习记忆能力
力竭游泳运动后12 h、24 h和1周，分别实施Morris水迷宫实验。Morris水迷宫实验包括定位航行实验和空间搜索实验。定位航行实验：均等划分水迷宫为4个象限，第工象限为目标象限（置有平台），2d时间里，对小鼠进行每天8次的找平台训练（上午和下午各训练4次，每次2 min）。每次记录下小鼠寻找到隐藏在水下平台的时间（逃避潜伏期escape latency）；空间搜索实验：第三天，撤除水下平台，将小鼠从第三象限放入，记录120 s内小鼠在4个象限的游泳時间，衡量小鼠对原目标象限的记忆保持情况。
1.4前脑皮层和海马免疫组织化学染色
水迷宫实验后即刻，注射0.4%的戊巴比妥钠，麻醉小鼠，开胸灌注生理盐水和预冷的4%多聚甲醛溶液；断头取脑，固定，脱水，透明，石蜡包埋，制备切片（片厚5μm）。将切片脱蜡水化，去除内源性酶后，严格按照免疫组织化学染色程序、SABC试剂盒操作说明进行。选择小鼠脑内海马CA1区、CA3区、齿状回（DG）和前脑皮层（PFC），切片后随机选取视野，400倍显微拍照，Motic Images Advanced 3.2图像处理系统分析测量GDNF阳性细胞平均目标灰度值。
1.5数理统计方法
采用SPSS 13.0进行统计，所有数据以平均数±标准差（x±s）表示。各组间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并进行后续检验的多重比较，逃避潜伏期采用重复测量方差分析，进行LSD-t检验或非配对t检验。显著水平为P<0.05，非常显著水平为P<0.01。
2结果
2.1小鼠空间学习能力测试结果
小鼠空间定位航行和空间搜索能力测试结果如图1所示，随训练次数的增加，对照组和力竭游泳后各组小鼠的逃避潜伏期均出现显著减少（P<0.05，P<0.01）。力竭游泳运动后12 h，小鼠1～4训练周期的逃避潜伏期均非常显著高于对照组（P<0.01），力竭游泳运动后24 h的小鼠各训练周期逃避潜伏期表现出相似的特征；与对照组相比，力竭游泳运动后1 w小鼠在训练周期3和4时的逃避潜伏期明显增加（P<0.05）；与力竭游泳运动后12 h和24 h组相比，小鼠力竭游泳运动后1 w后各训练周期的逃避潜伏期出现不同程度的下降。结果表明，反复力竭游泳运动后12 h和24 h可导致小鼠空间学习能力降低，力竭游泳运动后1周小鼠的空间学习能力出现不同程度的恢复。
2.2小鼠空间搜索记忆能力测试结果 空间搜索实验中，各组小鼠游泳时间测试结果如表1所示。各组小鼠在第一象限的游泳时间均高于第二、三和四象限，尤其是对照组和力竭游泳运动后1周组，小鼠在第二、三和四三个象限的游泳时间显著低于第一象限的游泳时间（P<0.05，P<0.01）；与对照组比较，力竭运动游泳运动后12 h小鼠第一象限停留时间非常显著减少（P<0.01），力竭运动游泳运动后24 h小鼠第一象限停留时间显著减少（P<0.05），但比力竭游泳运动后12 h组有所增加。测试结果说明，小鼠力竭游泳运动后12h，其空间记忆保持能力非常显著减弱，力竭游泳运动后24h，其空间记忆保持能力显著减弱。
2.3力竭运动后小鼠前脑皮层和海马GDNF的表达
免疫组织化学结果显示，GDNF阳性细胞在海马和前脑皮层广泛表达（见图2）。各组小鼠海马和前脑皮层的GDNF阳性细胞胞浆呈棕黄色。对照组、力竭游泳后一周组小鼠脑区GDNF表达相对较多，CA1区、CA3区、DG区和前脑皮层GDNF阳性细胞均分布广泛，细胞排列整齐，结构规整。力竭游泳后即刻（O h）和12 h小鼠各脑区GDNF阳性细胞数明显减少，排列较为松散。力竭游泳后即刻24 h小鼠海马DG区和前脑皮层GDNF表达相对较低，阳性细胞数目减少。
各组小鼠海马CAl区、CA3区、DG区和前脑皮层GDNF阳性细胞平均目标灰度值的计算结果如表2所示。与对照组相比，力竭游泳后即刻（0 h）和12 h小鼠各脑区GDNF阳性细胞平均目标灰度值均明显增多（P<0.05，P<0.01），说明小鼠各脑区GDNF的表达显著减少；力竭游泳后24 h，小鼠海马DG和前脑皮层GDNF阳性细胞平均目标灰度值明显增多（P<0.05）；力竭游泳后一周，小鼠各脑区GDNF阳性细胞平均目标灰度值与正常对照组比较无显著性差异（P>0.05），说明各脑区GDNF的表达有所恢复。结果表明，力竭游泳运动后脑海马CA1、CA3、DG和前脑皮层GDNF的表达明显降低。
3讨论
适当运动可改善脑的学习与记忆功能，但过度运动可能引起大脑神经组织结构性损伤，一旦导致运动性中枢疲劳发生，就会造成运动过程中神经调节功能减退。研究表明，海马与记忆能力及空间认知能力有关，其中海马CA3区与空间认知性的学习能力有着密切关系。在力竭训练引起的海马神经元功能改变过程中，海马内NF-κB信号转导系统和脑源性神经营养因子（BDNF）对海马神经元的损伤起保护作用。长期大运动量训练作为一种慢性应激，可影响脑内海马和大脑皮层神经元的功能活动。行为学实验检测结果表明，通过长时间低强度的跑台运动训练可显著提高大鼠的空间学习能力和记憶功能。这种改变可能与运动应激改善了海马区突触可塑性有关，在海马区功能改善的过程中神经营养因子可能发挥了重要作用。
胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）是一种在体内有广泛表达并且作用复杂的多效能神经营养因子，其对由于过度运动应激及脑缺血等因素引起的神经元损伤具有保护作用，在海马和前额叶皮质中均检测到了GDNF表达的增强，这可能是神经系统受到损伤后启动自我修复机制中的重要因素。GDNF表达异常可能会直接影响大鼠海马突触传递效能，继而导致大鼠的空间学习记忆能力下降。另有研究表明，海马是学习记忆的重要脑区，且在介导应激反应中具有重要的调节作用。慢性应激在影响脑内海马的同时，对前额叶、杏仁核等脑区也有影响。因此推测本研究中小鼠空间学习记忆功能减退以及运动性中枢疲劳的产生和恢复可能与海马和前脑皮层GDNF的表达密切相关。
4小结
4.1力竭游泳运动引起小鼠空间记忆保持能力下降，海马及前脑皮层神经组织受损，继而导致海马和前脑皮层神经组织中GDNF的表达上调，暗示GDNF参与了运动疲劳适应过程中的神经组织细胞修复过程。
4.2力竭运动后不同时间GDNF动态变化特点表明，GDNF参与了运动引起的中枢疲劳产生与恢复的生物学调控过程，这将为研究运动训练及比赛中产生的中枢疲劳问题提供理论依据。
关键词：力竭运动；空间记忆；GDNF；海马；前脑皮层
中图分类号：G804.5 文献标识码：A 文章编号：1009—9840（2016）04—0055—04
近年来，运动性疲劳一直是竞技体育领域的研究热点，尤其是对运动中枢疲劳的研究。长期大运动量训练后，中枢疲劳一旦发生，将会引起机体发生一系列改变，如动作控制能力下降，学习记忆能力减弱，运动认知出现偏差等，继而引起运动成绩下降。出现这些现象的主要原因可能是，过度运动应激导致了前脑皮层和海马的损伤。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）在神经元细胞的生长与死亡调控过程中发挥了不可替代的作用，其生物学效应倍受关注。研究表明，GDNF在神经细胞及神经相关细胞中有广泛表达。当大鼠受到外伤性脑损伤后，对受损海马部位的GDNF进行检测，发现GDNF表达增强。本研究通过检测力竭游泳运动后不同时间小鼠前脑皮层、海马GDNF的表达，探讨过度运动应激引起中枢疲劳产生及恢复的可能机制，为运动训练调控提供理论依据。
1研究对象与方法
1.1研究对象
3月龄小鼠20只（健康昆明品系，雌雄各半），体重22～26克，山东大学生命科学学院细胞生物学实验室提供。国家标准啮齿类动物饲料，自由饮食，分笼饲养，每笼5只。温度24℃～26℃，相对湿度40%～60%。
将动物适应性喂养一周后，按体重随机分为2组，对照组10只，运动组10只。
1.2建立力竭运动模型
适应性训练：30±2℃水温，适应性自由泳训练3d，第一天15min，第二天30 min，第三天45min。
反复性力竭游泳运动训练：连续4周，每周游泳训练5天，每天1次，均游泳至力竭；为避免小鼠产生适应现象，在训练的后期增加训练强度（加2%体重的负重物）。训练结束后，捞起吹干，放回笼中休息。
力竭的判断标准为：1）动作失调，无法坚持继续游泳；2）沉入水底，超过3 s不能回到水面。
1.3检测学习记忆能力
力竭游泳运动后12 h、24 h和1周，分别实施Morris水迷宫实验。Morris水迷宫实验包括定位航行实验和空间搜索实验。定位航行实验：均等划分水迷宫为4个象限，第工象限为目标象限（置有平台），2d时间里，对小鼠进行每天8次的找平台训练（上午和下午各训练4次，每次2 min）。每次记录下小鼠寻找到隐藏在水下平台的时间（逃避潜伏期escape latency）；空间搜索实验：第三天，撤除水下平台，将小鼠从第三象限放入，记录120 s内小鼠在4个象限的游泳時间，衡量小鼠对原目标象限的记忆保持情况。
1.4前脑皮层和海马免疫组织化学染色
水迷宫实验后即刻，注射0.4%的戊巴比妥钠，麻醉小鼠，开胸灌注生理盐水和预冷的4%多聚甲醛溶液；断头取脑，固定，脱水，透明，石蜡包埋，制备切片（片厚5μm）。将切片脱蜡水化，去除内源性酶后，严格按照免疫组织化学染色程序、SABC试剂盒操作说明进行。选择小鼠脑内海马CA1区、CA3区、齿状回（DG）和前脑皮层（PFC），切片后随机选取视野，400倍显微拍照，Motic Images Advanced 3.2图像处理系统分析测量GDNF阳性细胞平均目标灰度值。
1.5数理统计方法
采用SPSS 13.0进行统计，所有数据以平均数±标准差（x±s）表示。各组间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并进行后续检验的多重比较，逃避潜伏期采用重复测量方差分析，进行LSD-t检验或非配对t检验。显著水平为P<0.05，非常显著水平为P<0.01。
2结果
2.1小鼠空间学习能力测试结果
小鼠空间定位航行和空间搜索能力测试结果如图1所示，随训练次数的增加，对照组和力竭游泳后各组小鼠的逃避潜伏期均出现显著减少（P<0.05，P<0.01）。力竭游泳运动后12 h，小鼠1～4训练周期的逃避潜伏期均非常显著高于对照组（P<0.01），力竭游泳运动后24 h的小鼠各训练周期逃避潜伏期表现出相似的特征；与对照组相比，力竭游泳运动后1 w小鼠在训练周期3和4时的逃避潜伏期明显增加（P<0.05）；与力竭游泳运动后12 h和24 h组相比，小鼠力竭游泳运动后1 w后各训练周期的逃避潜伏期出现不同程度的下降。结果表明，反复力竭游泳运动后12 h和24 h可导致小鼠空间学习能力降低，力竭游泳运动后1周小鼠的空间学习能力出现不同程度的恢复。
2.2小鼠空间搜索记忆能力测试结果 空间搜索实验中，各组小鼠游泳时间测试结果如表1所示。各组小鼠在第一象限的游泳时间均高于第二、三和四象限，尤其是对照组和力竭游泳运动后1周组，小鼠在第二、三和四三个象限的游泳时间显著低于第一象限的游泳时间（P<0.05，P<0.01）；与对照组比较，力竭运动游泳运动后12 h小鼠第一象限停留时间非常显著减少（P<0.01），力竭运动游泳运动后24 h小鼠第一象限停留时间显著减少（P<0.05），但比力竭游泳运动后12 h组有所增加。测试结果说明，小鼠力竭游泳运动后12h，其空间记忆保持能力非常显著减弱，力竭游泳运动后24h，其空间记忆保持能力显著减弱。
2.3力竭运动后小鼠前脑皮层和海马GDNF的表达
免疫组织化学结果显示，GDNF阳性细胞在海马和前脑皮层广泛表达（见图2）。各组小鼠海马和前脑皮层的GDNF阳性细胞胞浆呈棕黄色。对照组、力竭游泳后一周组小鼠脑区GDNF表达相对较多，CA1区、CA3区、DG区和前脑皮层GDNF阳性细胞均分布广泛，细胞排列整齐，结构规整。力竭游泳后即刻（O h）和12 h小鼠各脑区GDNF阳性细胞数明显减少，排列较为松散。力竭游泳后即刻24 h小鼠海马DG区和前脑皮层GDNF表达相对较低，阳性细胞数目减少。
各组小鼠海马CAl区、CA3区、DG区和前脑皮层GDNF阳性细胞平均目标灰度值的计算结果如表2所示。与对照组相比，力竭游泳后即刻（0 h）和12 h小鼠各脑区GDNF阳性细胞平均目标灰度值均明显增多（P<0.05，P<0.01），说明小鼠各脑区GDNF的表达显著减少；力竭游泳后24 h，小鼠海马DG和前脑皮层GDNF阳性细胞平均目标灰度值明显增多（P<0.05）；力竭游泳后一周，小鼠各脑区GDNF阳性细胞平均目标灰度值与正常对照组比较无显著性差异（P>0.05），说明各脑区GDNF的表达有所恢复。结果表明，力竭游泳运动后脑海马CA1、CA3、DG和前脑皮层GDNF的表达明显降低。
3讨论
适当运动可改善脑的学习与记忆功能，但过度运动可能引起大脑神经组织结构性损伤，一旦导致运动性中枢疲劳发生，就会造成运动过程中神经调节功能减退。研究表明，海马与记忆能力及空间认知能力有关，其中海马CA3区与空间认知性的学习能力有着密切关系。在力竭训练引起的海马神经元功能改变过程中，海马内NF-κB信号转导系统和脑源性神经营养因子（BDNF）对海马神经元的损伤起保护作用。长期大运动量训练作为一种慢性应激，可影响脑内海马和大脑皮层神经元的功能活动。行为学实验检测结果表明，通过长时间低强度的跑台运动训练可显著提高大鼠的空间学习能力和记憶功能。这种改变可能与运动应激改善了海马区突触可塑性有关，在海马区功能改善的过程中神经营养因子可能发挥了重要作用。
胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）是一种在体内有广泛表达并且作用复杂的多效能神经营养因子，其对由于过度运动应激及脑缺血等因素引起的神经元损伤具有保护作用，在海马和前额叶皮质中均检测到了GDNF表达的增强，这可能是神经系统受到损伤后启动自我修复机制中的重要因素。GDNF表达异常可能会直接影响大鼠海马突触传递效能，继而导致大鼠的空间学习记忆能力下降。另有研究表明，海马是学习记忆的重要脑区，且在介导应激反应中具有重要的调节作用。慢性应激在影响脑内海马的同时，对前额叶、杏仁核等脑区也有影响。因此推测本研究中小鼠空间学习记忆功能减退以及运动性中枢疲劳的产生和恢复可能与海马和前脑皮层GDNF的表达密切相关。
4小结
4.1力竭游泳运动引起小鼠空间记忆保持能力下降，海马及前脑皮层神经组织受损，继而导致海马和前脑皮层神经组织中GDNF的表达上调，暗示GDNF参与了运动疲劳适应过程中的神经组织细胞修复过程。
4.2力竭运动后不同时间GDNF动态变化特点表明，GDNF参与了运动引起的中枢疲劳产生与恢复的生物学调控过程，这将为研究运动训练及比赛中产生的中枢疲劳问题提供理论依据。