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摘要 為明确滇重楼Paris polyphylla var. yunnanensis （Franch） Hand.-Mazz一种新的叶斑病病原菌，以云南省丽江市玉龙纳西族自治县中药材种植基地内发现的一种新真菌性病害为供试研究材料，经单孢分离培养、形态特征观察、致病性测定、多基因系统发育分析（ITS、tub2、tef1）和生物学特性测定，对病原物进行分类鉴定。研究结果表明，病原物CL107形态符合Pestalotiopsis sp.种属典型特征;菌株CL107-ITS（accession no. MK156295）、CL107-BT（accession no. MN015425）、CL107-EF1（accession no. MN022941）与参比标准菌株P.oryzae CBS 353.69同源性分别为100.00%、100.00%、98.92%，可将稻曲拟盘多毛孢P.oryzae确定为滇重楼叶斑病病原物。生物学特性研究表明，PDA培养基、pH 8.0、28℃、全黑暗条件有利于菌株CL107菌丝生长和分生孢子形成，以葡萄糖为碳源有利于纯化菌株菌丝生长和产孢;以酵母提取物为氮源有利于纯化菌株菌丝生长，以牛肉膏为氮源有利于纯化菌株产孢。本研究首次报道稻曲拟盘多毛孢P.oryzae可侵染滇重楼植株，引起真菌性叶斑病，明确影响病害发生的环境因子，为该叶斑病的诊断与防治提供科学依据和理论指导。
关键词 滇重楼; 叶斑病; 稻曲拟盘多毛孢; 生物学特性
中图分类号： S 435.67
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019497
Abstract
In order to characterize a new fungal leaf spot disease of Paris polyphylla var. yunnanensis （Franch） Hand.-Mazz， the fungal pathogens were isolated in a Chinese herbal medicine planting base in Yulong Naxi autonomous county， Lijiang， Yunnan. The pathogens were classified and identified based on single spore isolation culture， morphological observation， pathogenicity assay， multi-gene phylogenetic analysis （ITS， tub2， tef1） and biological characteristics. The results showed that the pathogen morphology of CL107 was consistent with the typical characteristics of Pestalotiopsis sp.; strains CL107-ITS （accession no. MK156295）， CL107-BT （accession no. MN015425）， CL107-EF1 （accession no. MN022941） and the reference standard strain P.oryzae CBS 353.69 shared a high homology of 100.00%， 100.00% and 98.92%， respectively. P.oryzae was the leaf spot disease pathogen of P.polyphylla var. yunnanensis. The biological characteristics of the strain CL107 was beneficial to mycelial growth and conidial formation in PDA medium at pH 8.0， 28℃， and under all dark conditions. The use of glucose as the C source was beneficial to the growth and sporulation of the purified strains. The yeast extract was used as the N source， which was beneficial to the mycelium growth of the purified strain， and the beef extract used as the N source could facilitate the sporulation of the purified strain. This study firstly reported that P.oryzae could infect P.polyphylla var. yunnanensis， which caused fungal leaf spot. The environmental factors affecting the occurrence of the disease were also identified， which would provide a scientific basis and theoretical support for the prevention and control of the leaf spot disease.
Key words Paris polyphylla var. yunnanensis; leaf spot disease; Pestalotiopsis oryzae; biological characteristics 滇重楼Paris polyphylla var. yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz，别名独角莲，多年生草本植物，具清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效，是我国一种重要的传统药用植物，主要分布在云南、四川、贵州等地[1-2]。云南是我国药用植物资源种类最丰富的地区，也是滇重楼主要的种植区。近年来，由于长期的掠夺性采挖和飙升的药用需求量，使得野生滇重楼种质资源急剧减少，目前依靠人工种植满足市场需求[3]。随着滇重楼种植产业的不断发展，由于种植管理模式、自然气候条件等方面的不足，滇重楼各类病害问题日益凸显。据前人研究报道，云南省中药材种植区滇重楼病害种类主要有根腐病[4-5]、软腐病[6-7]、立枯病[8]、细菌性穿孔病[8]、白霉病[4，9]、褐斑病[9]、灰霉病[10]等; 由重楼柱隔孢Ramularia paris引起的白霉病和细链孢Alternaria tenuis 引起的褐斑病是目前已报道的两种滇重楼叶部病害。滇重楼叶斑病主要为害叶片，植株发病时叶片正面形成圆形、椭圆形或不规则的病斑，严重时感病植株叶片正面病斑连片，变褐枯黄甚至植株死亡，直接影响滇重楼的产量和品质，给种植户带来巨大的经济损失;同时叶斑病也成为大规模发展滇重楼种植业的潜在威胁，且此类病害的防治已成为生产中极为突出的问题。
近年来，关于Pestalotiopsis sp.种属的分类已有大量的研究报道，主要集中在分生孢子的形态特征和寄主的专一性方面，研究者对种属分类鉴定的依据大多相似，因而给此类微生物的鉴定工作带来了较大的难题[11-12]。随着分子生物学的飞速发展，多基因系统发育分析已成为植物病原菌分类鉴定可信度较高的技术手段。Liu等[13]运用ITS和β-tubulin对Pestalotiopsis sp.真菌进行多基因系统发育分析，并结合形态特征观察，发现分生孢子内着色的细胞颜色是相对稳定的，可作为此类真菌分类的重要依据。李曼等[14]采用形态学鉴定和ITS、tef1多基因测序对植物内生Pestalotiopsis sp.真菌进行系统发育分析，认为分生孢子顶端细胞的附属丝是否呈匙状膨大是对拟盘多毛孢暗色类群进一步分类鉴定的重要特征。Maharachchikumbura等[15-16]选择ACT、β-tubulin、CAL、GAPDH、GS、LSU、RPB1、SSU、ITS和tef1等10个基因对Pestalotiopsis sp.真菌进行分类定种，研究结果表明ITS、β-tubulin和tef1等3个基因的鉴定效果较好;此外，将ITS、β-tubulin和tef1 3个基因序列联合分析能更准确可靠地对Pestalotiopsis sp.真菌进行种属的区分。本研究采用此方法对供试病原菌株进行分子生物学鉴定和多基因系统发育分析，探明其详细分类信息，为病害防控提供理论支撑。
目前，国内外尚未有关于稻曲拟盘多毛孢P.oryzae在滇重楼上危害的研究报道。据此，本研究通过对滇重楼叶斑病病原分子生物学鉴定及生物学特性测定，明确滇重楼叶斑病病原物及其详细分类信息，探索影响病害发生流行的环境因素，以期为该病害的田间诊断和有效防治提供科学依据和理论支撑。
1 材料与方法
1.1 供试菌株与材料
本研究具典型叶斑病症状的滇重楼标样采自云南省丽江市玉龙纳西族自治县中药材种植基地（100°23′28″E，26°51′43″N）。采用组织分离法分离病原菌，切取3 mm×3 mm大小病健交界处的叶片组织，用10%次氯酸钠溶液浸泡20 s，然后用75%乙醇消毒30 s，最后用无菌水漂洗3次，转至PDA平板培养基中央，25℃黑暗条件下恒温培养至菌落产孢，分离菌株单孢纯化培养，并保存备用。
供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基、查氏（Czapek）培养基、水琼脂（water agar， WA）培养基、燕麦琼脂（OA）培养基、滇重楼汁液（PLA）培养基、滇重楼汁液 PDA（PLA PDA）培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基、MKB培养基，9种培养基的制备参照陈全助等[17]，穆晓红等[18]的方法进行。
1.2 致病性测定
根据柯赫氏法则，选取滇重楼植株健康叶片，以直径5 mm的菌饼作为接种体，采用无伤接种法，并放置于MGC-450HP人工气候箱内（25～30℃）保湿培养，定期观察并记录植株发病情况。以无菌水处理作空白对照，每处理4次重复。待植株发病后，分离发病植株叶片病斑上的病原物，于Nikon Eclipse E200荧光生物显微镜下观察孢子形态，并与接种菌株孢子形态比较。
1.3 病原鉴定
1.3.1 形态特征观察
无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至PDA培养基上，25℃黑暗条件下恒温培养至菌落形成，观察菌落培养性状;待菌株产孢后，在Nikon Eclipse E200荧光生物显微镜下观察并测量产孢结构和分生孢子的形态及大小。
1.3.2 多基因系统发育分析
采用CTAB法提取纯化菌株总DNA[19]。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增菌株ITS序列[20]，采用T1（5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′）和BT2B（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）扩增菌株β-tubulin （tub2）序列[21]，采用EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）和EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）扩增菌株tef1序列[22]。PCR反应采用热启动程序，所用到的10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTPs均购自大连宝生物科技有限公司。PCR 30 μL反应体系：10 mmol/L 10×PCR Buffer 3.0 μL、2 mmol/L dNTPs 2.0 μL、5 U/μL Taq酶0.5 μL、10 mmol/L正向引物和反向引物各1.0 μL、DNA模板1.5 μL，ddH2O 21.0 μL。ITS反應程序：95℃预变性3 min;95℃变性1 min，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃ 延伸10 min，4℃条件下保存。β-tubulin反应程序：95℃预变性3 min;94℃变性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，30个循环;72℃ 延伸10 min，4℃条件下保存。tef1反应程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，63℃退火55 s，72℃延伸90 s，10个循环;94℃变性30 s，53℃退火55 s，72℃延伸90 s，36个循环，72℃ 延伸7 min，4℃条件下保存。 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，送至上海生工生物工程有限公司测序。测序结果经BLAST 搜索（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）后与 GenBank数据库中相关种属的基因序列进行比较分析，选用同源性较高的模式菌株序列作为参比对象，用Clustal X 1.8软件进行多序列比对，计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性。系统发育分析时排除碱基缺失位点，采用最大似然法（maximum likelihood analysis）用MEGA 7.0构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。其中，Bootstrap值设定为1 000，其余均为默认值。
1.4 生物学特性测定
1.4.1 不同培养基对菌株菌丝生长和产孢的影响
无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼分别接种至上述9种供试平板培养基中央，并放置于25℃恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。
1.4.2 温度对菌株菌丝生长和产孢的影响
以PDA培养基为基础培养基，无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至PDA培养基中央，分别放置于5、10、15、20、25、28、30、32、35℃等9个温度梯度恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。
1.4.3 光照对菌株菌丝生长和产孢的影响
以PDA培养基为基础培养基，无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至PDA平板培养基中央，分别放置于25℃ 24 h全暗、12 h光照 12 h黑暗、24 h光照条件下恒温培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。
1.4.4 pH对菌株菌丝生长和产孢的影响
以PDA培养基为基础培养基，用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH溶液分别将培养基pH值调为40、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等8个不同梯度。无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至不同pH的PDA平板培养基中央，并放置于25℃恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。
1.4.5 碳、氮源对菌株菌丝生长和产孢的影响
以Czapek培养基为基础培养基，分别以相同含量的麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇作为碳源，不添加碳源作无碳空白对照;分别以相同含量的蛋白胨、KNO3、酵母粉、牛肉膏、NaNO3、NH4Cl作为氮源，不添加氮源作无氮空白对照。无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至不同pH值PDA平板培养基中央，并放置于25℃恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。
1.5 数据分析处理
测定数据均采用Duncan氏新复极差法检验不同处理间的差异显著性，数据结果利用DPS 7.05统计软件计算分析，图用Sigma Plot 12.5绘制。
2 结果与分析
2.1 病害症状与致病性测定
将种植基地采集到的滇重楼叶斑病标样进行病原组织分离和单孢培养，获得纯化单孢菌株1株，记作CL107。经致病性测定，纯化单孢菌株CL107能侵染滇重楼并引起叶斑病。滇重楼健康叶片接种纯化菌株并感病后，发病初期老叶叶片上有圆形或不规则的褐色病斑，病斑中心发白，边缘呈暗褐色，有明显轮纹;当培养环境较潮湿时，病斑正面由褐色变为黑褐色，并附着大量的黑色小点，即为叶斑病病原菌的分生孢子堆，背面附着灰色霉层。这与田间滇重楼植株发病症状相一致（图1a、b），并且能从植株接种发病部位再分离到先前的接种菌，以无菌去离子水接种的空白对照植株不表现发病症状（图1c）。根据柯赫氏法则，可将纯化单孢菌株CL107确定为滇重楼叶斑病致病菌。
2.2 病原菌鉴定结果
2.2.1 形态特征观察
单孢菌株CL107于PDA平板培养基25℃黑暗条件恒温培养5 d后，菌落呈近圆形，正面白色，气生菌丝浓密呈絮状;背面淡黄色，具轮纹，菌落直径4.98～5.25 cm（图1d、e）。培养15 d后，菌落表面形成少量黑色黏液即为分生孢子堆，排列不规则，轮纹状较5 d时更明显，无气味（图1f）。菌株CL107成熟分生孢子呈直或略弯的纺锤状，具3～4个隔膜，大小（13.52～28.08）μm×（3.02～7.57）μm，孢子平均大小为23.25 μm×5.47 μm，中間3个细胞着色，上部2个细胞呈深褐色，细胞间隔处颜色较深，第3个细胞呈浅褐色，着色细胞长12.4～15.7 μm;分生孢子梗呈白色圆柱状且较短，长2.7～5.5 μm;分生孢子顶端和尾端的细胞均呈圆锥状，无色透明，顶端细胞有2～3根无色透明附属丝，不分支，长11.3～24.8 μm（图1g、h）。滇重楼接种发病状态下，单孢菌株CL107分生孢子盘附着于叶片背面，呈黑色粒点状，孢子形态大小与纯化菌株培养结果一致（图1i）。根据以上观测特征结果，并参考前人研究结果[23-26]，将单孢菌株CL107初步确定为稻曲拟盘多毛孢P.oryzae。
2.2.2 分子生物学鉴定和系统发育进化树 对分离病原单孢菌株CL107的ITS、tub2和tef1多基因进行扩增测序，获得目的基因片段分别为588、779、266 bp，GenBank登录号分别为MK156295、MN015425、MN022941。经Blast 搜索并与 GenBank数据库中相关种属基因序列比较分析后，菌株CL107与Pestalotiopsis sp.具较高的同源性，挑选亲缘性较高的同属不同种菌株作为参比菌株，用Clustal X 1.8进行多序列比对，并采用最大似然法（maximum likelihood analysis）用MEGA 7.0构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。结果表明，菌株CL107-ITS（accession no. MK156295）、CL107-BT（accession no. MN015425）、CL107-EF1（accession no. MN022941）分别与参比标准菌株P.oryzae CBS 353.69（accession no. NR147547）、P.oryzae CBS 353.69（accession no. KM199398）、P.oryzae CBS 353.69（accession no. KM199496）的相似性达100.00%、100.00%、98.92%，菌株间具较高同源性;结合形态特征鉴定结果，可将代表性单孢菌株CL107鉴定为稻曲拟盘多毛孢P.oryzae。
2.3 菌株生物学特性測定
2.3.1 不同培养基对菌株菌丝生长和产孢的影响
不同培养基对菌株CL107菌丝生长和孢子形成具有一定的影响（表1）。供试培养基中，菌株CL107在PDA平板培养基上生长最快，在MKB平板培养基上生长最慢，与其余几种供试培养基相比差异显著（P
关键词 滇重楼; 叶斑病; 稻曲拟盘多毛孢; 生物学特性
中图分类号： S 435.67
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019497
Abstract
In order to characterize a new fungal leaf spot disease of Paris polyphylla var. yunnanensis （Franch） Hand.-Mazz， the fungal pathogens were isolated in a Chinese herbal medicine planting base in Yulong Naxi autonomous county， Lijiang， Yunnan. The pathogens were classified and identified based on single spore isolation culture， morphological observation， pathogenicity assay， multi-gene phylogenetic analysis （ITS， tub2， tef1） and biological characteristics. The results showed that the pathogen morphology of CL107 was consistent with the typical characteristics of Pestalotiopsis sp.; strains CL107-ITS （accession no. MK156295）， CL107-BT （accession no. MN015425）， CL107-EF1 （accession no. MN022941） and the reference standard strain P.oryzae CBS 353.69 shared a high homology of 100.00%， 100.00% and 98.92%， respectively. P.oryzae was the leaf spot disease pathogen of P.polyphylla var. yunnanensis. The biological characteristics of the strain CL107 was beneficial to mycelial growth and conidial formation in PDA medium at pH 8.0， 28℃， and under all dark conditions. The use of glucose as the C source was beneficial to the growth and sporulation of the purified strains. The yeast extract was used as the N source， which was beneficial to the mycelium growth of the purified strain， and the beef extract used as the N source could facilitate the sporulation of the purified strain. This study firstly reported that P.oryzae could infect P.polyphylla var. yunnanensis， which caused fungal leaf spot. The environmental factors affecting the occurrence of the disease were also identified， which would provide a scientific basis and theoretical support for the prevention and control of the leaf spot disease.
Key words Paris polyphylla var. yunnanensis; leaf spot disease; Pestalotiopsis oryzae; biological characteristics 滇重楼Paris polyphylla var. yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz，别名独角莲，多年生草本植物，具清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效，是我国一种重要的传统药用植物，主要分布在云南、四川、贵州等地[1-2]。云南是我国药用植物资源种类最丰富的地区，也是滇重楼主要的种植区。近年来，由于长期的掠夺性采挖和飙升的药用需求量，使得野生滇重楼种质资源急剧减少，目前依靠人工种植满足市场需求[3]。随着滇重楼种植产业的不断发展，由于种植管理模式、自然气候条件等方面的不足，滇重楼各类病害问题日益凸显。据前人研究报道，云南省中药材种植区滇重楼病害种类主要有根腐病[4-5]、软腐病[6-7]、立枯病[8]、细菌性穿孔病[8]、白霉病[4，9]、褐斑病[9]、灰霉病[10]等; 由重楼柱隔孢Ramularia paris引起的白霉病和细链孢Alternaria tenuis 引起的褐斑病是目前已报道的两种滇重楼叶部病害。滇重楼叶斑病主要为害叶片，植株发病时叶片正面形成圆形、椭圆形或不规则的病斑，严重时感病植株叶片正面病斑连片，变褐枯黄甚至植株死亡，直接影响滇重楼的产量和品质，给种植户带来巨大的经济损失;同时叶斑病也成为大规模发展滇重楼种植业的潜在威胁，且此类病害的防治已成为生产中极为突出的问题。
近年来，关于Pestalotiopsis sp.种属的分类已有大量的研究报道，主要集中在分生孢子的形态特征和寄主的专一性方面，研究者对种属分类鉴定的依据大多相似，因而给此类微生物的鉴定工作带来了较大的难题[11-12]。随着分子生物学的飞速发展，多基因系统发育分析已成为植物病原菌分类鉴定可信度较高的技术手段。Liu等[13]运用ITS和β-tubulin对Pestalotiopsis sp.真菌进行多基因系统发育分析，并结合形态特征观察，发现分生孢子内着色的细胞颜色是相对稳定的，可作为此类真菌分类的重要依据。李曼等[14]采用形态学鉴定和ITS、tef1多基因测序对植物内生Pestalotiopsis sp.真菌进行系统发育分析，认为分生孢子顶端细胞的附属丝是否呈匙状膨大是对拟盘多毛孢暗色类群进一步分类鉴定的重要特征。Maharachchikumbura等[15-16]选择ACT、β-tubulin、CAL、GAPDH、GS、LSU、RPB1、SSU、ITS和tef1等10个基因对Pestalotiopsis sp.真菌进行分类定种，研究结果表明ITS、β-tubulin和tef1等3个基因的鉴定效果较好;此外，将ITS、β-tubulin和tef1 3个基因序列联合分析能更准确可靠地对Pestalotiopsis sp.真菌进行种属的区分。本研究采用此方法对供试病原菌株进行分子生物学鉴定和多基因系统发育分析，探明其详细分类信息，为病害防控提供理论支撑。
目前，国内外尚未有关于稻曲拟盘多毛孢P.oryzae在滇重楼上危害的研究报道。据此，本研究通过对滇重楼叶斑病病原分子生物学鉴定及生物学特性测定，明确滇重楼叶斑病病原物及其详细分类信息，探索影响病害发生流行的环境因素，以期为该病害的田间诊断和有效防治提供科学依据和理论支撑。
1 材料与方法
1.1 供试菌株与材料
本研究具典型叶斑病症状的滇重楼标样采自云南省丽江市玉龙纳西族自治县中药材种植基地（100°23′28″E，26°51′43″N）。采用组织分离法分离病原菌，切取3 mm×3 mm大小病健交界处的叶片组织，用10%次氯酸钠溶液浸泡20 s，然后用75%乙醇消毒30 s，最后用无菌水漂洗3次，转至PDA平板培养基中央，25℃黑暗条件下恒温培养至菌落产孢，分离菌株单孢纯化培养，并保存备用。
供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基、查氏（Czapek）培养基、水琼脂（water agar， WA）培养基、燕麦琼脂（OA）培养基、滇重楼汁液（PLA）培养基、滇重楼汁液 PDA（PLA PDA）培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基、MKB培养基，9种培养基的制备参照陈全助等[17]，穆晓红等[18]的方法进行。
1.2 致病性测定
根据柯赫氏法则，选取滇重楼植株健康叶片，以直径5 mm的菌饼作为接种体，采用无伤接种法，并放置于MGC-450HP人工气候箱内（25～30℃）保湿培养，定期观察并记录植株发病情况。以无菌水处理作空白对照，每处理4次重复。待植株发病后，分离发病植株叶片病斑上的病原物，于Nikon Eclipse E200荧光生物显微镜下观察孢子形态，并与接种菌株孢子形态比较。
1.3 病原鉴定
1.3.1 形态特征观察
无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至PDA培养基上，25℃黑暗条件下恒温培养至菌落形成，观察菌落培养性状;待菌株产孢后，在Nikon Eclipse E200荧光生物显微镜下观察并测量产孢结构和分生孢子的形态及大小。
1.3.2 多基因系统发育分析
采用CTAB法提取纯化菌株总DNA[19]。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增菌株ITS序列[20]，采用T1（5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′）和BT2B（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）扩增菌株β-tubulin （tub2）序列[21]，采用EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）和EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）扩增菌株tef1序列[22]。PCR反应采用热启动程序，所用到的10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTPs均购自大连宝生物科技有限公司。PCR 30 μL反应体系：10 mmol/L 10×PCR Buffer 3.0 μL、2 mmol/L dNTPs 2.0 μL、5 U/μL Taq酶0.5 μL、10 mmol/L正向引物和反向引物各1.0 μL、DNA模板1.5 μL，ddH2O 21.0 μL。ITS反應程序：95℃预变性3 min;95℃变性1 min，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃ 延伸10 min，4℃条件下保存。β-tubulin反应程序：95℃预变性3 min;94℃变性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，30个循环;72℃ 延伸10 min，4℃条件下保存。tef1反应程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，63℃退火55 s，72℃延伸90 s，10个循环;94℃变性30 s，53℃退火55 s，72℃延伸90 s，36个循环，72℃ 延伸7 min，4℃条件下保存。 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，送至上海生工生物工程有限公司测序。测序结果经BLAST 搜索（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）后与 GenBank数据库中相关种属的基因序列进行比较分析，选用同源性较高的模式菌株序列作为参比对象，用Clustal X 1.8软件进行多序列比对，计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性。系统发育分析时排除碱基缺失位点，采用最大似然法（maximum likelihood analysis）用MEGA 7.0构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。其中，Bootstrap值设定为1 000，其余均为默认值。
1.4 生物学特性测定
1.4.1 不同培养基对菌株菌丝生长和产孢的影响
无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼分别接种至上述9种供试平板培养基中央，并放置于25℃恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。
1.4.2 温度对菌株菌丝生长和产孢的影响
以PDA培养基为基础培养基，无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至PDA培养基中央，分别放置于5、10、15、20、25、28、30、32、35℃等9个温度梯度恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。
1.4.3 光照对菌株菌丝生长和产孢的影响
以PDA培养基为基础培养基，无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至PDA平板培养基中央，分别放置于25℃ 24 h全暗、12 h光照 12 h黑暗、24 h光照条件下恒温培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。
1.4.4 pH对菌株菌丝生长和产孢的影响
以PDA培养基为基础培养基，用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH溶液分别将培养基pH值调为40、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等8个不同梯度。无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至不同pH的PDA平板培养基中央，并放置于25℃恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。
1.4.5 碳、氮源对菌株菌丝生长和产孢的影响
以Czapek培养基为基础培养基，分别以相同含量的麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇作为碳源，不添加碳源作无碳空白对照;分别以相同含量的蛋白胨、KNO3、酵母粉、牛肉膏、NaNO3、NH4Cl作为氮源，不添加氮源作无氮空白对照。无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至不同pH值PDA平板培养基中央，并放置于25℃恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。
1.5 数据分析处理
测定数据均采用Duncan氏新复极差法检验不同处理间的差异显著性，数据结果利用DPS 7.05统计软件计算分析，图用Sigma Plot 12.5绘制。
2 结果与分析
2.1 病害症状与致病性测定
将种植基地采集到的滇重楼叶斑病标样进行病原组织分离和单孢培养，获得纯化单孢菌株1株，记作CL107。经致病性测定，纯化单孢菌株CL107能侵染滇重楼并引起叶斑病。滇重楼健康叶片接种纯化菌株并感病后，发病初期老叶叶片上有圆形或不规则的褐色病斑，病斑中心发白，边缘呈暗褐色，有明显轮纹;当培养环境较潮湿时，病斑正面由褐色变为黑褐色，并附着大量的黑色小点，即为叶斑病病原菌的分生孢子堆，背面附着灰色霉层。这与田间滇重楼植株发病症状相一致（图1a、b），并且能从植株接种发病部位再分离到先前的接种菌，以无菌去离子水接种的空白对照植株不表现发病症状（图1c）。根据柯赫氏法则，可将纯化单孢菌株CL107确定为滇重楼叶斑病致病菌。
2.2 病原菌鉴定结果
2.2.1 形态特征观察
单孢菌株CL107于PDA平板培养基25℃黑暗条件恒温培养5 d后，菌落呈近圆形，正面白色，气生菌丝浓密呈絮状;背面淡黄色，具轮纹，菌落直径4.98～5.25 cm（图1d、e）。培养15 d后，菌落表面形成少量黑色黏液即为分生孢子堆，排列不规则，轮纹状较5 d时更明显，无气味（图1f）。菌株CL107成熟分生孢子呈直或略弯的纺锤状，具3～4个隔膜，大小（13.52～28.08）μm×（3.02～7.57）μm，孢子平均大小为23.25 μm×5.47 μm，中間3个细胞着色，上部2个细胞呈深褐色，细胞间隔处颜色较深，第3个细胞呈浅褐色，着色细胞长12.4～15.7 μm;分生孢子梗呈白色圆柱状且较短，长2.7～5.5 μm;分生孢子顶端和尾端的细胞均呈圆锥状，无色透明，顶端细胞有2～3根无色透明附属丝，不分支，长11.3～24.8 μm（图1g、h）。滇重楼接种发病状态下，单孢菌株CL107分生孢子盘附着于叶片背面，呈黑色粒点状，孢子形态大小与纯化菌株培养结果一致（图1i）。根据以上观测特征结果，并参考前人研究结果[23-26]，将单孢菌株CL107初步确定为稻曲拟盘多毛孢P.oryzae。
2.2.2 分子生物学鉴定和系统发育进化树 对分离病原单孢菌株CL107的ITS、tub2和tef1多基因进行扩增测序，获得目的基因片段分别为588、779、266 bp，GenBank登录号分别为MK156295、MN015425、MN022941。经Blast 搜索并与 GenBank数据库中相关种属基因序列比较分析后，菌株CL107与Pestalotiopsis sp.具较高的同源性，挑选亲缘性较高的同属不同种菌株作为参比菌株，用Clustal X 1.8进行多序列比对，并采用最大似然法（maximum likelihood analysis）用MEGA 7.0构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。结果表明，菌株CL107-ITS（accession no. MK156295）、CL107-BT（accession no. MN015425）、CL107-EF1（accession no. MN022941）分别与参比标准菌株P.oryzae CBS 353.69（accession no. NR147547）、P.oryzae CBS 353.69（accession no. KM199398）、P.oryzae CBS 353.69（accession no. KM199496）的相似性达100.00%、100.00%、98.92%，菌株间具较高同源性;结合形态特征鉴定结果，可将代表性单孢菌株CL107鉴定为稻曲拟盘多毛孢P.oryzae。
2.3 菌株生物学特性測定
2.3.1 不同培养基对菌株菌丝生长和产孢的影响
不同培养基对菌株CL107菌丝生长和孢子形成具有一定的影响（表1）。供试培养基中，菌株CL107在PDA平板培养基上生长最快，在MKB平板培养基上生长最慢，与其余几种供试培养基相比差异显著（P