CD24在人胚肾上皮细胞Hek293中的表达及检测

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  [摘要] 目的 构建含有CD24基因的重组质粒,在人胚肾上皮细胞Hek293中表达出具有免疫原性的抗原。方法 用PCR方法扩增CD24基因,克隆到载体pYD5-hFC中,获得重组质粒pYD5-CD24,转化DH10α感受态细胞中,挑选克隆抽取质粒,以脂质体介导将质粒转染Hek293细胞,72 h后收集细胞培养上清,Western-Blot分析鉴定。结果 构建了含有CD24基因的重组质粒,并在人胚肾上皮细胞Hek293中获得带有hFC标签的CD24蛋白。结论 本研究成功表达出了具有免疫原性的CD24蛋白。
  [关键词] CD24;表达;Western
  [中图分类号] R741 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2012)29-0047-02
  CD24基因编码唾液酸糖蛋白锚定在细胞表面糖基磷脂酰肌醇链上,在成熟的粒细胞和许多B细胞中都有表达[1],它作为黏附分子对调节肿瘤细胞生长、增殖及侵袭等均具有重要作用[2],且其高表达及表达模式与患者生存率及预后密切相关,是多种肿瘤有价值的诊断和预后指标[3]。
  真核表达系统表达水平高,表达产物可进行翻译后加工,其抗原性、免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似等特点,被广泛应用于各种不同外源基因的表达。本文以真核表达系统表达CD24基因,对表达产物的特异性进行鉴定,并对核蛋白的免疫原性进行初步研究,为CD24基因工程亚单位疫苗的研制及诊断抗原的研究做进一步的探索。
  1 材料与方法
  1.1材料
  CD24模版购自美国open biosysterms公司,DH10α感受态细胞自己制备,限制性内切酶HindIII、BamHI购自NEB公司,T4连接酶、 Taq DNA聚合酶购自美国TAKARA公司,Hek293细胞株、F17培养基、F68、脂质体cellfectine、抽质粒试剂盒均购自invitrogen公司,Anti-CD24鼠抗购自Abcam公司,HRP标记羊抗鼠IgGFc购自Sigma。
  1.2 细胞培养
  细胞培养参照文献[4]进行,具体步骤如下,Hek293细胞培养基:F17无血清培养基,培养条件:27℃,5%CO2。悬浮培养:细胞接种到无菌的三角瓶置于恒温摇床培养,转速120转/min,加入1%的F68,悬浮细胞密度一般维持在(0.5×106~1×106)cells/mL之间,一般传代(2~3)次/周。
  1.3 目的基因扩增
  根据CD24模板,PCR扩增全长基因。上游引物P1为5’GCCGTCTCGGATCCATGGGCAGAGCAATGGTGGC 3’,5’端加上BamHI酶切位点;下游引物P2为5’GCCGTCTCAAGCTTAAGAGTAGAGATGCAGAAGAG 3’,5’端加上HindIII酶切位点。扩增片断为240 bp,含有完整的CD24基因,引物由南京金思特科技有限公司合成。
  1.4重组质粒构建
  将PCR产物CD24经BamHI和HindIII双酶切,酶切条件:37℃,2 h,酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离回收(按说明书操作),回收的目的片段与pYD5载体连接,连接产物pYD5-CD24热击转化大肠杆菌感受态DH10α,涂布LB平板(平板中含有Amp),37℃培养过夜,挑独立的克隆接种于10 mL LB培养基中(Amp)震荡培养过夜。
  1.5酶切及测序
  收集细胞抽质粒进行酶切鉴定,1 mL送测序,1.5 mL保种。若测序正确,将保存菌种扩大培养抽质粒(按Invitrogen公司试剂盒说明书操作)。
  1.6细胞转染及表达分析
  转染在6孔板中进行,当细胞生长密度达到1×106 cells/mL时,利用脂质体(cellfectine)介导转染,转染后72 h左右收集细胞培养上清加入 loadingbuffer制得裂解液,根据Western bloting常规操作做WB检测。一抗:CD24单克隆抗体。二抗:是HRP标记羊抗鼠IgGFc。
  2 结果与分析
  2.1 目的基因扩增结果
  PCR扩增出的CD24基因,经1%琼脂糖凝胶电泳检测,得到一条大约240 bp的特异性条带,与预期片段大小相符(图1)。
  图1 CD24的PCR分析
  1:2000 marker;2:CD24
  2.2 重组质粒鉴定结果
  重组质粒pYD5-CD24转化感受态细胞DH10α,在含有氨苄抗生素的LB培养板上挑取独立克隆培养,抽出质粒进行双酶切,酶切结果如图2。酶切后得到大约6 kb和240 bp两片段,分别与pYD5载体和CD24基因分子质量一致。测序结果证明载体pYD5和CD24基因接头连接处正确,大小和读码框架正确完整。
  2.3 Western bloting分析结果
  Western bloting结果如图3,转入CD24的Hek293细胞表达得到一条37 kD左右的带,与预测的37.4 kD相符,说明表达出来的真核蛋白能与CD24单克隆抗体发生免疫反应。
  3 结论
  研究发现CD24可促进大肠癌细胞的增殖,同时激活Raf-ERK通路及p38MAPK激酶[5],也与卵巢上皮性肿瘤恶性程度相关[6],此外与乳腺癌标本中CD44 CD24-细胞E-钙黏连水平明显下降[7]。CD24的表达与胃癌肿瘤病理学分级、临床分期及淋巴结转移有相关性,同时CD24的异常表达可能与胃癌的早期发生有关[8]。CD24可能与食管鳞癌(ESCC)淋巴结转移(LNM)相关[9]。树突状细胞受脂多糖刺激后CD24表达显著增高,这有利于DC-T细胞簇的形成及抗原的递呈,从而导致DC免疫功能的增强[10]。CD24表达可能是反映前列腺癌发生、进展、生物学行为和预后的重要癌干细胞标记物[11]。CD24在病理分级高的胰腺癌中表达高于分级低者,且恶性程度高的原发癌患者CD24表达明显增强[12]。这些提示CD24在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色[13]。   本研究采用真核表达系统在Hek293细胞中表达重组CD24蛋白,真核系统与大肠杆菌等原核表达系统相比,能更好地保持蛋白的免疫原性,且pYD5载体为CD24加入hFC标签以利于蛋白的纯化。用Western Blot方法进行检测,确定在Hek293细胞中表达出了真核蛋白,分子量约为37.4 kD,与预计的结果相符,且与CD24单克隆抗体发生良好的免疫反应,这表明重组核蛋白保持了天然核蛋白的免疫原性,为进一步研究该蛋白奠定了基础。
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  (收稿日期:2012-09-03)
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