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【摘要】 目的：观察原发性ITP患儿外周血血小板抗体及淋巴细胞亚群变化，探讨其与ITP的关系及临床意义。方法：采用流式细胞技术检测患儿与正常儿童外周血血小板相关抗体（PAIgA、G、M）水平及淋巴细胞亚群（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD19+、CD3-CD（16+56）+）水平。结果：新诊断ITP组与持续性ITP组PAIg（G、M）水平明显高于正常儿童（P<0.001）；新诊断性ITP组与持续性ITP组和对照组比较，CD3+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值、CD3-CD（16+56）+NK细胞降低，CD3+CD8+T细胞、CD19+B细胞升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：原发性ITP患儿存在细胞免疫和体液免疫紊乱，血小板相关抗体和淋巴细胞亚群水平检测的联合使用对原发性ITP的诊断、疗效评估有较好的实用价值。
【关键词】 原发性ITP； 血小板相关抗体； 流式细胞术； 淋巴细胞亚群
原发性免疫性血小板减少症，过去也称为特发性血小板减少性紫癜是一种获得性自身免疫性疾病，以没有明显原因的单纯性血小板减少（血小板计数<100×109/L）为特征[1]。目前研究普遍认为，原发性ITP发病机制不仅与抗血小板抗体所介导的血小板破坏有关，同时血小板生成减少、T细胞的介导影响也发挥了重要作用[2]，但确切机制仍未完全明确。本文就血小板相关抗体、淋巴细胞亚群与原发性ITP发生的关系及其临床意义进行探讨。
1 资料与方法
1.1 一般资料 89例原发性ITP患儿均为2011年9月-2012年8月本院收治的住院患儿，诊断符合文献诊断标准[3]。其中男54例，女35例，年龄2个月～14岁，平均（4.69±2.79）岁，均为初次发病。新诊断组（诊断后3个月以内血小板减少）66例，持续性组（诊断后3～12个月血小板持续减少）23例。选择25例体检健康儿童作对照组，男15例，女10例，年龄9个月～12岁，平均（5.07±2.12）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 主要试剂与仪器 单克隆抗体CD41-PE、FITC标记的羊F（ab’）2抗IgG（阴性对照）、羊F（ab’）2抗人IgG（γ）FITC、羊F（ab’）2抗人IgM（μ）FITC、羊F（ab’）2抗人IgA（α）FITC单克隆抗体均为Coulter公司产品。CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5、CD3-FITC/CD（16+56）-PE、CD19-PC5及溶血素均为Coulter公司产品。FC500型流式细胞仪为美国Coulter公司。
1.3 方法
1.3.1 流式细胞术检测血小板相关抗体 将EDTA抗凝全血经低速离心富集、洗涤血小板后，以CD41-PE进行荧光标记处理，然后分别以FITC标记的羊F（ab’）2抗IgG（阴性对照）、羊F（ab’）2抗人IgG（γ）FITC、羊F（ab’）2抗人IgM（μ）FIT、羊F（ab’）2抗人IgA（α）FITC标记血小板，洗涤后上机测定。
1.3.2 流式细胞术检测淋巴细胞亚群 采集空腹静脉血2ml（EDTA抗凝）取2支流式细胞仪专用试管分别标记1、2，管1加5μl CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5，管2分别加5μl CD3-FITC/CD（16+56）-PE、CD19-PC5，在每支试管中再加入20 μl抗凝全血，充分混匀，室温避光孵育30 min后，加入溶血素100 μl使红细胞溶解，1200 r/min离心5 min，弃上清液，PBS洗涤1次，最后以500 μl PBS缓冲液悬浮，上机测定。
1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，首先对检测数据采用非参数Kruskal-Wallis检验，组间比较采用秩变换分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原发性ITP患者外周血PAIg检测结果 新诊断组与持续性组PAIg（G、M）水平显著高于对照组，比较差异有统计学意义（P<0.001）；新诊断组与持续性组间血小板抗体水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.2 原发性ITP患者外周血淋巴细胞亚群检测结果 新诊断性ITP组与持续性ITP组和对照组比较，CD3+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值、CD3-CD（16+56）+NK细胞降低，CD3+CD8+T细胞、CD19+B细胞升高，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；新诊断性ITP组与持续性ITP组比较，组间CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值、CD19+T细胞、CD3+CD8+T细胞差异均有统计学意义（P<0.05），两组CD3-CD（16+56）+NK细胞比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
3 讨论
原发性ITP是儿童期好发的一种自身免疫性出血性疾病，以自身抗体产生导致血小板破坏增多而致外周血血小板减少。关于ITP的发病机制复杂多样，其中单核-巨噬细胞系统中自身抗体介导的血小板破坏增加、骨髓巨核细胞损伤或功能异常使血小板生成减少，被认为是经典的ITP发病机制[4]。这些抗体主要表现为IgG增高，有时表现为IgM或IgA增高[5]。本文实验结果显示，新诊断组与持续性组PAIgG、PAIgM和对照组相比显著增高（P<0.001），而持续性组PAIg水平与新诊断组相比差异无统计学意义（P>0.05），这与文献[6]报道基本一致，提示PAIg检测无法鉴别新诊断ITP与持续性ITP，但可作为ITP诊断的辅助指标。
近年来随着研究的深入，发现ITP患者体内存在着多种T淋巴细胞异常，Cines D B等[7]认为T细胞异常导致B细胞激活可能才是ITP真正的发病机制。本文结果显示，新诊断组与持续性组CD3+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值细胞明显低于正常儿童，CD3+CD8+T细胞、CD19+B细胞明显高于正常儿童，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；持续性组与新诊断组比较，除NK细胞差异无统计学意义（P>0.05）外，其他淋巴细胞亚群差异均有统计学意义（P<0.05）。NK细胞对B细胞分化有抑制作用，能调节吞噬作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。研究发现激活的NK细胞能够抑制ITP的自身免疫反应[8]。ITP患儿NK细胞数量和对照组相比显著降低（P<0.05）提示其对B细胞激活、增殖、分化和抗体应答抑制能力下降，从而使B细胞异常活化，体液免疫过强而发病。 综上所述，细胞免疫与体液免疫在ITP发病中起了重要作用，血小板相关抗体和淋巴细胞亚群水平检测的联合使用对ITP的诊断及疗效观察有较好的实用价值，在治疗上要注意纠正免疫失衡，运用免疫调节手段治疗ITP。
参考文献
[1] Rodeghiere F， Stasi R， Gernsheimer T， et al. Standardization of terminology， definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children： report form an international working group[J]. Blood，2009，113（11）：2386-2393.
[2] Zhang F， Chu X， Wang L， et al. Cell-mediated lysis of autologous platelets in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura[J]. Eur J Haematol，2006，76（5）：427-431.
[3] 张之南.血液病诊断及疗效标准[M].第3版.北京：科学出版社，2008：172-175.
[4] 孟美丽，黄瑞滨.特发性血小板减少性紫癜患者血小板特异性抗体的表达、意义及检测[J].江西医药，2009，44（3）：279-282.
[5] Chong B H， Ho S J. Autoimmune thrombocytopenia[J]. Thromb Haemost，2005，3：1763-1772.
[6] 尹亚飞，罗自勉.血小板相关抗体在特发性血小板减少性紫癜诊治中的临床意义[J].临床医学，2012，32（1）：4-5.
[7] Cines D B， McMillan R. Pathogenesis of chronic immune thrombocytopenic Purpura[J]. Curropin Hematol，2007，14（5）：511-514.
[8] Johasson U， Macey M G， Kenny D， et al. The role of natural killer T cells in immune thrombocytopenia： is strong in vitro NKT cell activity related to the development of remission[J]. Br J Haematol，2005，129（4）：564-565.
（收稿日期：2012-11-09）
（本文编辑：王宇）
【关键词】 原发性ITP； 血小板相关抗体； 流式细胞术； 淋巴细胞亚群
原发性免疫性血小板减少症，过去也称为特发性血小板减少性紫癜是一种获得性自身免疫性疾病，以没有明显原因的单纯性血小板减少（血小板计数<100×109/L）为特征[1]。目前研究普遍认为，原发性ITP发病机制不仅与抗血小板抗体所介导的血小板破坏有关，同时血小板生成减少、T细胞的介导影响也发挥了重要作用[2]，但确切机制仍未完全明确。本文就血小板相关抗体、淋巴细胞亚群与原发性ITP发生的关系及其临床意义进行探讨。
1 资料与方法
1.1 一般资料 89例原发性ITP患儿均为2011年9月-2012年8月本院收治的住院患儿，诊断符合文献诊断标准[3]。其中男54例，女35例，年龄2个月～14岁，平均（4.69±2.79）岁，均为初次发病。新诊断组（诊断后3个月以内血小板减少）66例，持续性组（诊断后3～12个月血小板持续减少）23例。选择25例体检健康儿童作对照组，男15例，女10例，年龄9个月～12岁，平均（5.07±2.12）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 主要试剂与仪器 单克隆抗体CD41-PE、FITC标记的羊F（ab’）2抗IgG（阴性对照）、羊F（ab’）2抗人IgG（γ）FITC、羊F（ab’）2抗人IgM（μ）FITC、羊F（ab’）2抗人IgA（α）FITC单克隆抗体均为Coulter公司产品。CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5、CD3-FITC/CD（16+56）-PE、CD19-PC5及溶血素均为Coulter公司产品。FC500型流式细胞仪为美国Coulter公司。
1.3 方法
1.3.1 流式细胞术检测血小板相关抗体 将EDTA抗凝全血经低速离心富集、洗涤血小板后，以CD41-PE进行荧光标记处理，然后分别以FITC标记的羊F（ab’）2抗IgG（阴性对照）、羊F（ab’）2抗人IgG（γ）FITC、羊F（ab’）2抗人IgM（μ）FIT、羊F（ab’）2抗人IgA（α）FITC标记血小板，洗涤后上机测定。
1.3.2 流式细胞术检测淋巴细胞亚群 采集空腹静脉血2ml（EDTA抗凝）取2支流式细胞仪专用试管分别标记1、2，管1加5μl CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5，管2分别加5μl CD3-FITC/CD（16+56）-PE、CD19-PC5，在每支试管中再加入20 μl抗凝全血，充分混匀，室温避光孵育30 min后，加入溶血素100 μl使红细胞溶解，1200 r/min离心5 min，弃上清液，PBS洗涤1次，最后以500 μl PBS缓冲液悬浮，上机测定。
1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，首先对检测数据采用非参数Kruskal-Wallis检验，组间比较采用秩变换分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原发性ITP患者外周血PAIg检测结果 新诊断组与持续性组PAIg（G、M）水平显著高于对照组，比较差异有统计学意义（P<0.001）；新诊断组与持续性组间血小板抗体水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.2 原发性ITP患者外周血淋巴细胞亚群检测结果 新诊断性ITP组与持续性ITP组和对照组比较，CD3+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值、CD3-CD（16+56）+NK细胞降低，CD3+CD8+T细胞、CD19+B细胞升高，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；新诊断性ITP组与持续性ITP组比较，组间CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值、CD19+T细胞、CD3+CD8+T细胞差异均有统计学意义（P<0.05），两组CD3-CD（16+56）+NK细胞比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
3 讨论
原发性ITP是儿童期好发的一种自身免疫性出血性疾病，以自身抗体产生导致血小板破坏增多而致外周血血小板减少。关于ITP的发病机制复杂多样，其中单核-巨噬细胞系统中自身抗体介导的血小板破坏增加、骨髓巨核细胞损伤或功能异常使血小板生成减少，被认为是经典的ITP发病机制[4]。这些抗体主要表现为IgG增高，有时表现为IgM或IgA增高[5]。本文实验结果显示，新诊断组与持续性组PAIgG、PAIgM和对照组相比显著增高（P<0.001），而持续性组PAIg水平与新诊断组相比差异无统计学意义（P>0.05），这与文献[6]报道基本一致，提示PAIg检测无法鉴别新诊断ITP与持续性ITP，但可作为ITP诊断的辅助指标。
近年来随着研究的深入，发现ITP患者体内存在着多种T淋巴细胞异常，Cines D B等[7]认为T细胞异常导致B细胞激活可能才是ITP真正的发病机制。本文结果显示，新诊断组与持续性组CD3+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值细胞明显低于正常儿童，CD3+CD8+T细胞、CD19+B细胞明显高于正常儿童，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；持续性组与新诊断组比较，除NK细胞差异无统计学意义（P>0.05）外，其他淋巴细胞亚群差异均有统计学意义（P<0.05）。NK细胞对B细胞分化有抑制作用，能调节吞噬作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。研究发现激活的NK细胞能够抑制ITP的自身免疫反应[8]。ITP患儿NK细胞数量和对照组相比显著降低（P<0.05）提示其对B细胞激活、增殖、分化和抗体应答抑制能力下降，从而使B细胞异常活化，体液免疫过强而发病。 综上所述，细胞免疫与体液免疫在ITP发病中起了重要作用，血小板相关抗体和淋巴细胞亚群水平检测的联合使用对ITP的诊断及疗效观察有较好的实用价值，在治疗上要注意纠正免疫失衡，运用免疫调节手段治疗ITP。
参考文献
[1] Rodeghiere F， Stasi R， Gernsheimer T， et al. Standardization of terminology， definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children： report form an international working group[J]. Blood，2009，113（11）：2386-2393.
[2] Zhang F， Chu X， Wang L， et al. Cell-mediated lysis of autologous platelets in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura[J]. Eur J Haematol，2006，76（5）：427-431.
[3] 张之南.血液病诊断及疗效标准[M].第3版.北京：科学出版社，2008：172-175.
[4] 孟美丽，黄瑞滨.特发性血小板减少性紫癜患者血小板特异性抗体的表达、意义及检测[J].江西医药，2009，44（3）：279-282.
[5] Chong B H， Ho S J. Autoimmune thrombocytopenia[J]. Thromb Haemost，2005，3：1763-1772.
[6] 尹亚飞，罗自勉.血小板相关抗体在特发性血小板减少性紫癜诊治中的临床意义[J].临床医学，2012，32（1）：4-5.
[7] Cines D B， McMillan R. Pathogenesis of chronic immune thrombocytopenic Purpura[J]. Curropin Hematol，2007，14（5）：511-514.
[8] Johasson U， Macey M G， Kenny D， et al. The role of natural killer T cells in immune thrombocytopenia： is strong in vitro NKT cell activity related to the development of remission[J]. Br J Haematol，2005，129（4）：564-565.
（收稿日期：2012-11-09）
（本文编辑：王宇）